简介：椎间盘退变为引起颈肩痛、腰腿痛的主要原因，其确切的发生机理迄今仍不十分清楚，所以对椎间盘髓核细胞的研究越来越深入。椎间盘髓核细胞原代培养在研究髓核细胞生物学、转基因治疗以及组织工程等方面日渐成为一种不可缺少的技术。传统的酶消化法髓核细胞原代培养存在操作烦琐、污染率高以及胰蛋白酶和胶原酶的应用导致细胞活性降低等缺点。因此，有必要对其进行改进。

简介：目的：探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法：应用0．0625％的胰蛋白酶重复消化出生第2d乳鼠的心肌组织多次，收集的细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基中和，用差速贴壁分离法分离．在以溴脱氧尿嘧啶（Brdu）纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育7d。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个，且有活力心肌细胞占90％以上；培养4～6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长，12～24h明显增殖，3～4d后细胞融合成片；心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形。并出现自发性节律性搏动。结论：本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞，是一种可靠的心肌细胞培养方法。

简介：【目的】建立一种稳定高效的大鼠海马神经元体外原代培养的方法，并用免疫荧光方法鉴定神经元纯度。【方法】分离出生12h内的新生sD大鼠海马组织，胰蛋白酶消化，吹洗。收集上清液接种，4-5h后更换饲养液培养神经元，每3d换液1次，倒置显微镜下观察不同时期神经元形态学变化，采用DAPI和NeuN双染法鉴定神经元纯度。【结果】海马神经元生长状态良好，纯度达90％左右。【结论】该方法培养的sD大鼠海马神经元纯度高、生长状态良好，为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。

简介：目的：探讨高效的原代成年大鼠下颌骨成骨细胞培养方法，为进一步的实验研究奠定基础。方法：将4-6周SD成年大鼠处死并取出下颌骨，剪碎，用改良的酶消组织块培养法培养细胞，通过相差显微镜观察，用碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫荧光染色和钙结节染色等方法对所获得的细胞进行鉴定。结果：所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征，碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性。结论：改良的酶消组织块培养法，可获得大量高纯度的下颌骨成骨细胞，所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

简介：摘要目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml,成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。

简介：摘要目的探讨一种简便实用、成本低、纯度高并且成熟稳定的，体外培养人皮肤鳞状细胞癌癌细胞及建立原代细胞系的方法,为皮肤癌的研究奠定实验基础。方法对20份皮肤鳞癌患者的新鲜手术标本，采用组织块培养法和胶原酶消化悬液培养法进行体外培养。通过直接观察、细胞形态学观察和免疫细胞化学方法观察细胞的生长情况、细胞形态学特征及鉴定所得到的癌细胞情况。结果3份标本两种方法均培养出皮肤癌细胞,后者培养的细胞生长速度快。结论应用组织块和胶原酶消化法培养食管癌细胞,方法可行,适合推广应用。

简介：目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能.方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响.结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1～5d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P＜0.05).结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型.

简介：摘要目的建立猴支气管上皮细胞的原代培养方法，为进一步研究肺癌的发生机制奠定基础。方法体视显微镜下分离猴支气管粘膜层，用IV胶原酶消化粘膜层并培养猴原代支气管上皮细胞，采用鼠抗人角蛋白单克隆抗体(CK14)鉴定支气管上皮细胞。结果IV型胶原酶消化法成功培养猴原代支气管上皮细胞，使用鼠抗人角蛋白单克隆抗体成功鉴定所培养细胞为原代支气管上皮细胞。结论该方法是进行猴支气管上皮细胞原代培养的可行且有效的方法。

简介：人们最早采用整体动物实验研究化学物毒性及毒作用机制.随着细胞培养方法的建立和成熟,其在毒理学研究领域中的应用已越来越广泛.1967年Howard报道了用胶原酶和透明质酸酶灌流肝脏并分离肝细胞的新方法,使原代肝细胞的培养成为一种简便、快速、经济的毒理学体外实验系统.

简介：目的：建立和评价人牙龈成纤维细胞原代培养方法,并观察其生物学特性。方法：分别用组织块法、2种改良酶消组织块法培养人牙龈成纤维细胞（HGF）,用形态学、免疫荧光鉴定细胞来源。通过活细胞观察,MTT比色实验研究细胞体外生物特性。比较3种培养方法培养HGF的效果。结果：细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,符合人牙龈成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。组织块法、改良酶消组织块法（翻瓶法）、改良酶消组织块法（盖玻片法）的细胞培养成功率分别为26.7%、54%、60%。组织块法和2种改良酶消组织块法间的成功率差异有显著性（P〈0.01）,2种改良酶消组织块法间的成功率差异无显著性（P〉0.05）。结论：本实验建立的细胞系为人牙龈成纤维细胞。2种改良酶消化组织块法可显著提高人牙龈成纤维细胞原代培养成功率。

简介：神经细胞原代培养是研究神经细胞形态及功能的重要手段之一.传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养,无法满足在单一神经细胞培养基础上进行实验研究的需要.本实验在传统培养方法的基础上加以改良,对原混合培养方法在胎龄、取材、温度、消化、换液、抑制剂、机械操作等方面进行了控制和改进.本培养方法具体改进如下:1.运动神经细胞取自E14大鼠胚胎的脊髓.因为胚胎运动神经元形态分化和化学分化程度较低,体外存活能力强,E14胎鼠脊髓易剥离.而传统方法是取E12～E16.E12胎鼠组织太嫩,不易分离;E16胎鼠脊柱已部分骨化,血液太多,挑离脊髓时易形成撕裂损伤.2.取材时将脊髓沿冠状面切开,取脊髓腹侧半,改变传统的整个脊髓培养,以达到培养单一运动神经元的目的.3.整个取材过程在冰袋上进行,更好的保持细胞活力.4.严格控制胰酶的浓度和消化时间.胰酶浓度是0.125%,37℃二氧化碳孵育箱内消化0.5hr较好,采用4℃含血清的DMEM液适时终止反应.为避免组织丢失,改吸弃胰酶为吸组织于另一试管中,且迅速终止消化反应.5.减少传统方法中的吹打次数,用弯头吸管代替直头吸管吹打;取消离心或细胞筛过目等步骤,降低细胞损害程度.6.细胞种植后改传统换全液为换半液,改传统培养2d换液为定时观察,按需换液.这样不仅保证了细胞在已适应了的环境中生长,并且减少了污染的机率.7.本方法不使用抑制剂,减少药物对运动神经元的损伤,使神经细胞在更接近于体内自然环境中生长.种植细胞1～2hr即可观察到细胞贴壁,胞体呈圆形,饱满、透亮,有短的突起出现.因此,本方法的优点是:不仅能够大大缩短从取材到种植的时间,提高运动神经元的活性,而且成功的获得了相对单一的运动神经元培养物(纯度达90%以上),为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体

简介：摘要目的建立一种操作简单、稳定性好的大鼠肠肌间神经丛神经细胞的原代培养方案。方法2~4周龄健康雄性SD大鼠，取小肠分离出纵行肌间神经丛，使用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化，获取大鼠肠肌间神经丛神经细胞，使用含神经生长因子（GDNF）的Neurabasal A培养基进行培养。进行细胞形态学观察及细胞免疫荧光染色鉴定，膜片钳实验检测肠神经元细胞的静息膜电位和膜电阻。结果原代培养的大鼠肠神经元细胞生长良好。培养5~7 d的肠神经元细胞可见长的突起，神经元和神经胶质细胞网络紧密排列；培养45 d显示细胞皱缩、神经突触断裂，呈细胞凋亡表型。取培养5 d的肠神经元细胞进行膜片钳实验，记录其静息膜电位为（-49.5±1.5）mV、膜电阻为（500±38）MΩ（n=30）。结论本原代培养方案取材容易、培养方便、简单易行，细胞接种培养5~7 d可用于单细胞膜片钳实验，为深入研究神经细胞提供了可靠模型。

简介：目的探讨神经干细胞的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化.方法取孕16dWistar大鼠的胚鼠全脑,进行体外培养,并对培养的神经干细胞以及诱导分化的GABA能神经元进行鉴定.结果培养24h后,出现2～4个细胞的细胞球.分化2d后,神经球贴壁后伸出细长突起,并可和周边神经球伸出的突起连接.神经球周边可见大量散在贴壁的双极或多极细胞.免疫荧光染色可见神经球均有nestin、NF200、GFAP阳性细胞.取第3代神经球行GABA能神经元定向分化.分化24h后,实验组细胞球贴壁.3d后,实验组细胞球周边有大量散在分布细胞贴壁生长,胞体圆形较大,有1～2个细长突起.免疫荧光显示,实验组周边散在的贴壁细胞多为GAD65阳性细胞.GAD65阳性细胞分化率实验组(85.97±2.78)%、对照组(18.16±2.29)%,P<0.01.结论本实验利用寡核苷酸序列特异性阻断了bHLH基因家族的调控因子之一Hes1,解除了其对bHLH的抑制,促进了神经干细胞向神经元的分化.实验还发现,阻断Hes1后大大提高了神经干细胞向GABA神经元分化的比率.

简介：摘要目的建立大鼠肺动脉内皮细胞(PAEC)、肺静脉内皮细胞(PVEC)以及肺微血管内皮细胞(PMVEC)的体外分离和培养方法，分析3种肺血管内皮细胞的生物学特征及功能。方法本研究为实验研究。精分1只雄性SD大鼠肺动脉、肺静脉，肺组织取边缘剪碎，各样本分别用混合酶液消化，以血小板-内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)免疫磁珠法分选内皮细胞，用内皮细胞专用培养基培养。倒置显微镜下观察3种肺血管内皮细胞的形态差别，通过免疫荧光鉴定各组细胞纯度。通过免疫荧光和Western blot观察3组细胞血管性血友病因子(vWF)和平滑肌激动蛋白抗体(α-SMA)蛋白表达情况。通过基质胶体外成环实验比较3组细胞1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 h成环情况。采用SPSS 22.0和FlowJo 10软件进行统计学分析和统计作图。结果3组细胞24 h后均迅速贴壁，vWF免疫荧光染色均为阳性。3组细胞形态均为铺路石状，其中PAEC为典型的铺路石状，大多数呈椭圆形；而PVEC、PMVEC形态更细长。免疫荧光显示PVEC和PMVEC细胞浆内少量α-SMA蛋白弥散表达[(0.16±0.03)、(0.23±0.01)]，而PAEC中几乎观察不到α-SMA蛋白表达(0.06±0.01)。随着时间推移，3种肺血管内皮细胞成环周长均呈先上升后下降趋势，其中PVEC组成环长度最长。3组细胞成环周长在组间、时点间、时间和组间交互作用差异均具有统计学意义(P值均<0.01)。结论该方法所获得的3种肺血管内皮细胞纯度高，可在体外稳定培养。3种血管内皮细胞生物学功能有差别，其中PVEC体外成环能力最强。PAEC细胞表达α-SMA蛋白量最少。

简介：目的研究急性酒精暴露下对人原代培养肝细胞中CYP2E1依赖的毒性作用和氧化损伤.方法分离培养人原代肝细胞,以25～100mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞9h及100mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞0～24h后,检测人原代肝细胞中CYP2E1的含量,并研究100mmol/L乙醇作用于人原代肝细胞0～24h后,天冬氨酸转胺酶(aspartatetransaminase,AST)的释放量及肝细胞中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量.结果急性酒精暴露导致人原代肝细胞中CYP2E1的释放增加,并呈明显的剂量效应和时间效应关系;在100mmol/L乙醇作用下,AST和MDA明显升高,在0～24h内呈明显的时间效应关系,而GSH含量在6h后明显降低.结论100mmol/L乙醇急性暴露可导致人原代培养肝细胞明显的氧化损伤,这种损伤与CYP2E1活性的变化直接相关.

简介：目的探索原代培养成年大型哺乳动物绵羊阴道平滑肌细胞（vaginalsmoothmusclecells,VSMC）改良方法。方法成年绵羊阴道平滑肌取材,利用预消化组织块法（将组织剪碎呈1mm3大小组织块,0.1%Ⅰ型胶原酶消化20min,0.1%胰酶-EDTA与0.1%Ⅰ型胶原酶混合溶液再次消化30min,将组织块种于培养瓶）原代培养VSMC,并与传统组织块法和酶消化法进行细胞萌出速度及增殖速度比较,提高VSMC原代培养效率;免疫荧光染色法和westernbloting法检测平滑肌细胞标志物calponin及a-SMA表达鉴定VSMC。结果预消化组织块法获得原代VSMC速度快于传统组织块法和酶消化法,3d可见细胞萌出,9d可达80%细胞融合,＂峰谷＂特征明显,而酶消化法至12d增殖至80%细胞汇合,传统组织块法约7d可见细胞萌出,14d可达80%细胞汇合;VSMC平滑肌标志物calponin和a-SMA均呈阳性表达（P〈0.05）;VSMC可扩增代数有限,扩增7代后即表现出细胞形态改变,增殖缓慢,胞核内出现空泡,死亡细胞增加等表现。结论预消化组织块法可较快速多量获得绵羊VSMC。

简介：摘要目的寻找不同比例脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）对甲状旁腺细胞增殖能力及甲状旁腺激素（PTH）分泌功能变化的影响及规律。方法无菌条件下获取10只SD大鼠两侧甲状旁腺及腹股沟脂肪，经过消化分离分别获取甲状旁腺细胞和ADMSCs进行体外培养，采用流式检测方法对P3代ADMSCs表型进行检测。按照甲状旁腺细胞与ADMSCs比例为2∶1、1∶1、1∶2和1∶5进行共培养，观察不同共培养比例下两种细胞的生长状态，并取细胞上清进行PTH含量的测定。测定结果与对应数量单独培养的甲状旁腺细胞上清中PTH进行对比，利用细胞形态学和PTH检测结果综合判断ADMSCs对甲状旁腺细胞PTH分泌功能的影响。采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。结果可较稳定地完成体外单独甲状旁腺细胞与ADMSCs原代培养，且两种细胞不同比例的体外共培养显示出对PTH分泌的不同影响，其中甲状旁腺细胞与ADMSCs比例为1∶5时体现出较强的促PTH分泌作用，高于单独甲状旁腺细胞培养，其PTH含量在第2、4、6、8天分别为［（1.3±0.0）比（0.8±0.1）、（1.3±0.0）比（0.9±0.0）、（1.7±0.5）比（0.9±0.0）、（1.7±0.0）比（1.2±0.2）］ng/L，差异有统计学意义（t值分别为25.46、64.30、3.32、7.16，P值均<0.05）；其次为比例为1∶2时，PTH水平呈上升趋势。结论甲状旁腺细胞与ADMSCs体外共培养具有可行性，且1∶5细胞比例下PTH分泌效果有着更显著的影响。

简介：摘要目的研究补肾中药干预雷公藤多苷(GTW)对原代培养大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法取3龄SD雌性幼鼠,采用血清药理学的方法，采用SP法检测其作用24h时对大鼠卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达。结果SP法检测Bcl-2蛋白表达结果显示，GTW组Bcl-2表达测值明显少于空白组，统计学分析有极显著性差异（P＜0.01）,提示雷公藤多苷组抑制Bcl-2表达。黄酮组、六味组Bcl-2表达与雷公藤多苷组相比均有极显著性差异（P＜0.01），且黄酮组表达较六味组有所增强，两组间统计学分析无显著性差异（P＞0.05）。结论雷公藤多苷对体外培养的卵巢颗粒细胞具有一定的影响。表现在促进细胞凋亡。菟丝子黄酮和六味地黄丸能有效的延缓了颗粒细胞的凋亡。

简介：SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用,SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用100mmol·L－1乙醇作用肝细胞后,SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72h肝细胞

简介：目的：观察在不同浓度HHS混合液中海马神经细胞葡萄糖的代谢状况。方法：将原代培养大白鼠胚胎的海马神经细胞暴露于不同浓度HHS混合液15min后，测其细胞内[^14C]脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量。结果：暴露于0．05％、0．1％和0．25％HHS混合液15min后，胞内脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量在15min和60min时明显增加(P<0．05)，与同一时间的对照值相比也明显升高(P<0．05)。及至1天和7天后，海马神经细胞内脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量恢复至实验前对照值水平(P>0．05)。结论：海马神经细胞在暴露于不同浓度的高晶体-高胶体渗透压混合液15min后，在60min内对葡萄糖的吸收增加，但至少需1-7天方可恢复到正常的葡萄糖代谢状态。