双歧杆菌代谢特性的研究

双歧杆菌代谢特性的研究

罗梦迪

许昌学院，河南 许昌461000

摘要：本研究旨在采用气相色谱—质谱联用(GC-MS)技术，检测并分析了双歧杆菌代谢产物及其细胞中脂肪酸的构成，以探究双歧杆菌代谢特性。研究结果表明，不同双歧杆菌脂肪酸存在一定不同，其含量在代谢物中存在较大差异。其中，棕榈酸、硬脂酸、二十四烷酸为各双歧杆菌代谢产物及细胞中的主要脂肪酸。各菌株代谢产物中，棕榈酸与硬脂酸质量浓度比值约为3.00左右；代谢产物无芥酸、二十四碳烯酸等。

关键词：双歧杆菌；代谢特性；探究

引言：双歧杆菌（Bifidobacterium）是人和动物体内重要的肠道菌群组成成员，从出生起就在人体宿主肠道中发挥重要作用。其不但能够协助机体进行常规消化吸收，还能与机体肠道内其他细菌协同，建立保护屏障，防治致病菌入侵，是人类重要共生微生物。在Tissier发现双歧杆菌以后，经过100多年的发展，人们发现了更多双歧杆菌属成员，也发掘了其重要作用，并应用于生活实践和临床。为进一步探究双歧杆菌，本研究对双歧杆菌代谢特性进行了探究，现将具体研究内容报道如下。

1一般资料与方法

1.1一般资料

于许昌地区分别使用一次性无菌药匙采集老人新鲜粪便共5份，置于无菌双歧杆菌BS液体培养基后放于医用冷藏箱中，迅速带回实验室，备用。

1.2研究方法

1.2.1老人源双歧杆菌的分离鉴定

①菌株富集、分离和纯化：在超净工作台内，用移液器吸取1ml已混匀的新鲜粪便液体置于加有抗生素(无菌莫匹罗星锂盐)的双歧杆菌BS液体培养基中，在厌氧罐内对双歧杆菌菌株进行富集，培养条件：37℃，24-48h。之后，用无菌生理盐水稀释至10-6，用移液器吸取1ml后三个梯度的相应稀释液于已加有显色剂(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D一半乳糖苷)的双歧杆菌BS固体培养基中，37℃厌氧培养72h。挑选30株颜色为蓝色的单菌落转接到双歧杆菌液体培养基中，培养48h后将菌悬液8，000×g离心5min得菌体，用30%甘油分别进行保藏，置于-80℃冰箱中，备用。

②双歧杆菌定性鉴定：染色，选取革兰式阳性菌株进行F6PPK实验。F6PPK是双歧杆菌属所特异性的糖代谢专有酶，与双歧杆菌在形态学上极易混淆的乳杆菌属不存在这种酶，因此可以用以鉴定双歧杆菌。

具体实验步骤及方法如下：

1)在37°环境下培养菌株；

2)取1mL菌悬液8，000×g离心2min，弃上清得菌体；

3)洗涤，弃上清液；

4)将菌体重悬于200μL添加了0.25%(w/v)TritonX-100的上述磷酸盐缓冲液中；

5)添加氟化钠、碘乙酸钠以及果糖-6-磷酸，37℃水浴1h；

6)添加300μL6mg/mLpH=6.5的盐酸羟胺，室温静置10min；

7)分别添加200μL15%(w/v)的三氯乙酸和4mol/L的盐酸；

8)添加200μL含有5%(w/v)三氯化铁的0.1mol/L的盐酸，若混合体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌，并且红色越深表示该酶的活力越高。

③菌株的16SrDNA鉴定

双歧杆菌的基因组DNA的提取，实验步骤：

1)将F6PPK阳性菌株在BS液体培养基中培养，去掉上清液保留菌体；

2)清洗菌体，加入溶菌酶，去掉上清液保留菌体；

3)加入200μLSDS裂解液(2%TritonX-100，1%SDS，100mMNaCl，10mMTris，pH8.0，1mMEDTA)，80℃水浴30min；

4)加入酚-氯仿溶液，颠倒混匀，去上清液取菌体(具体体积视情况而定)；

6)加入400μL(2倍上清体积)的冰乙醇或冰异丙醇，弃上清液；

7)加入500μL70%(v/v)的冰乙醇重悬沉淀，12000×g离心1-3min，弃上清液；

8)自然晾干后用ddH2O重溶沉淀以备PCR。

然后进行菌株的16SrDNA的PCR扩增，PCR反应体系(25μL)为：上游引物27F1μL；下游引物1492R1μL；ddH2O9.5μL；DNA模板15μL；2×SanTaqPCRMix12.5μL，反应体系充分融合后需短暂离心。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃40s，72℃1.5min(循环35次)；94℃1min，55℃40s，72℃1.5min，12℃2min。PCR检查完成进行电泳验证，剩余PCR产物进行测序，后确定其种属。

1.2.2老人源双歧杆菌代谢产物中脂肪酸构成的研究

①脂肪酸GC-MS检测：培养菌株，取出培养菌液、离心。吸取离心后的上清液，放入具塞口玻璃试管内，皂化处理，水浴加热冷却萃取，甲酯化处理，带反应结束后，冷却，加入正己烷，静置，取适量正己烷相过0.22μm微孔滤膜，过滤液用于气相色谱-质谱分析。

②制备标准品溶液，备用。

1.2.3老人源双歧杆菌代谢产物中胞外多糖的研究

①双歧杆菌胞外多糖的制备：将老人源与标准双歧杆菌分别在BS培养基培养，除菌体，保留上清液，减压浓缩到原来体积的1/3，用3倍体积无水乙醇4℃沉淀24h。离心，去上清液，沉淀复溶于去离子水，除蛋白，透析，凝胶过滤，收集滤液，冷冻干燥，即可获取双歧杆菌胞外多糖干粉。

②双歧杆菌代谢物中胞外多糖及脂肪酸前处理：

胞外多糖GC-MS检测：取7mg胞外多糖纯品干粉，加入二甲基亚砜（DMSO），超声溶解，加Na0H粉末，密封，超声溶解，加入CH3I，搅拌反应。加入蒸馏水，中止反应，萃取，取萃取液。用水洗涤氯仿层，减压蒸干，即可获得甲基化多糖。在甲基化多糖中加入TFA溶液，水解。浓缩水解液，减压蒸干，获得部分甲基化单糖。将甲基化单糖中加入Na0H还原，后加入HAC中和，减压蒸干。加入无水吡啶和乙酸酐反应，减压蒸干，加入CH2C12溶解，滤膜过滤，过滤液用于GC-MS检测。

2结果

2.1 37种脂肪酸甲酯混标的GC-MS分析

根据色谱图，各组分分离状况良好，符合试验标准，以达到对脂肪酸进行定性，定量鉴定的要求。

2.2双歧杆菌代谢产物中的脂肪酸构成

检测结果显示：双歧杆菌代谢产物中，长链饱和脂肪酸(LCSFA)中的棕榈酸、硬脂酸和二十四烷酸质量浓度均较高，以上三种脂肪酸的质量浓度占总脂肪酸质量浓度的80%以上。其中棕搁酸质量浓度更高，与硬脂酸质量浓度比值超过2.50。

短链饱和脂肪酸(SCSFA)中，丁酸质量浓度更高。双歧杆菌代谢物多不饱和脂肪酸中，亚油酸质量浓度较高。此外，研究结果显示，总PUFA和总MUFA的质量浓度在BP-1(Bifidobacterium pseud-ocatenulatum BP-1)代谢产物中均最高，明显高于其他菌株，而动物双歧杆菌A6中，以上两种脂肪酸总质量浓度则最低。由此可见，在双歧杆菌发酵代谢中，不同双歧杆菌代谢物不同，其质量浓度存在明显差异。同种不同源的双歧杆菌间脂肪酸同样存在一定不同，差异明显。

2.3双歧杆菌细胞中的脂肪酸构成

双歧杆菌细胞中的脂肪酸检测结果显示：LCSFA是各菌株细胞中主要脂肪酸，其中又以棕榈酸、硬脂酸、二十四烷酸占比较大，为各菌株细胞主要脂肪酸。试验发现十二烷酸甘油三酯(C12:0)在长双歧杆菌BL-3细胞中含量最高，且显著高于动物双歧杆菌A6和假小链双歧杆菌BP-1。MUFA在菌株BL-3中的总含量与BA-5、A6、BP-1无明显差异，但明显高于BI-38(P<0.05)。与代谢产物相比，双歧杆菌细胞中未检测出芥酸、二十四碳烯酸、二十碳五烯酸。另外，在各菌株细胞中，共有11种脂肪酸在含量上均有至少2组组间差异明显(P<0.05)，且仅有MUFA在BL-3、BA-5中的总含量明显高于BI-38(P<0.05)。由此表明，细胞间不同双歧杆菌脂肪酸含量不同，存在一定差异。与代谢产物中的脂肪酸含量相比较，双歧杆菌细胞内脂肪酸含量偏低。

3结论

双歧杆菌作为现代医药中调节患者肠胃功能的主要成员之一，具有重要医疗作用。其即可调理患者肠道菌群，建立保护屏障，还能够在一定程度上辅助治疗肠道炎症，防治便秘与肠功能紊乱。研究其代谢特性对医药卫生事业发展，人民身体健康具有重要意义。本研究发现双歧杆菌脂肪酸含量在代谢产物间存在较为明显的差异。在细胞间同样存在差异，同种不同原双歧杆菌间存在脂肪酸差异。研究显示，双歧杆菌胞内脂肪酸含量明显地域代谢物中脂肪酸含量。其中，双歧杆菌代谢产物及其细胞中的主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、二十四烷酸。各菌株代谢产物中，棕榈酸质量浓度高于硬脂酸，质量浓度比值在2.607-3.120期间。另外，与代谢产物相比，各菌株细胞中并没有检测出芥酸、二十四碳烯酸、二十碳五烯酸。

细菌细胞内脂肪酸含量与占比具有细菌种属遗传稳定性，因此，在细菌种属，种类鉴定中具有一定参考性，可作为鉴定的特征标记。但通常情况下，外部生长环境的不同也会影响脂肪酸的构成。因此，在试验探究中，要保持生长环境相同。与此同时，从多角度多方向对其展开分析，以确保试验结论更具理论支撑性，进而达到其代谢特性探究的目的。

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基金项目：双歧杆菌代谢特性的研究

作者简介：罗梦迪（1990.9-）女，汉，籍贯：河南许昌，硕士，讲师，研究方向：医学，生物学