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【摘要】:细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。因此,细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础,特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等,具有非常广阔的应用前景[1]。随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】:流式细胞术;细胞内;细胞因子;检测技术
引言:细胞因子(cytokine,CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白,能介导细胞之间的相互作用,并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括:多参数流式细胞术,酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)和单细胞PCR等生物分析技术。相较于其它的检测方法,流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述
流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段,具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点,是目前先进的细胞定量分析技术之一。FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性,既可以定性,也可以定量,尤其适用于大量样品检测,已在临床检验工作中得到广泛应用。流式细胞仪(fluorescenceactivated cell sorter,FACS)的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
二、流式细胞术检测胞内细胞因子的优势
流式细胞术检测技术是一种在流式细胞仪的检测下,对微量样本的多项指标,给予定性和定量多重检测的技术。其具有以下几方面的优点:
流式细胞技术在进行细胞胞内因子测定的过程中,利用FCM与细胞内细胞因子(intracellular cytokine, ICK)染色技术相结合, 可提供一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[3]。它实现了在同一个细胞内既能同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析。最常检测的淋巴细胞亚群包括CD3^+CD4^+T细胞、CD3^+CD8^+T细胞、B淋巴细胞(CD19^+CD20^+)及NK细胞(CD16^+CD56^+)等。
流式细胞术检测胞内细胞因子时,对于样本的处理相对简便。可以直接用全血分析,也可以使用分离的PBMCs。
流式细胞术在胞内细胞因子检测中样本的选择上适应性广泛,可以使用新鲜的样品,也可以使用冻存的样品。
三、流式细胞术检测胞内细胞因子的操作方法
胞内细胞因子流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志物组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学试剂,荧光素与抗体选择,确保无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。其检测方法如下:
四、流式细胞术检测胞内细胞因子的关键控制因素
由于胞内分析步骤复杂,涉及变异因素多,可能会出现结果不稳定,较难重复等问题。因此,基于对实验成功率和可重复性的追求,经过反复实验,现总结出以下几点关键控制因素:
避免使用络合钙的抗凝剂,如ACD与EDTA,因为它们会限制钙依赖性激活过程,推荐用肝素钠。此外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%[4]。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
自然状态下,T淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中,T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来,胞内细胞因子信号较弱,难以进行检测。研究者必须采用体外激活以刺激细胞因子的表达。刺激剂根据实验目的的不同,可以选用的刺激剂也不同,比如PMA+ Ionomycin,SEB,LPS,PHA and Ionomycin,CD3+CD28抗体,以及特异性的相关抗原蛋白等[5]。刺激的时间也因研究目的和检测细胞因子的不同从几个小时到几天都有可能。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应将细胞因子阻断在胞内。细胞因子在高尔基体中合成,某些蛋白通过内质网运输以可溶性形式分泌至细胞外。破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,阻断其分泌。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素A)和/或Monensin (莫能霉素)。
特异的荧光标记抗体与细胞孵育标记细胞表面抗原,最好用含NaN 3及蛋白(FBS或BSA)的染色缓冲液稀释抗体。可按 PBS+1%FBS+0.1%NaN 3 pH7.4,配制洗涤缓冲液。
细胞胞内染色前必须固定通透,细胞通透同时或之前必须固定以保持细胞结构的完整性。固定剂主要成分为多聚甲醛,通透剂主要成分为皂素。这是两个比较重要的试剂,实验中最好设置阳性对照以验证这两个试剂的有效性。
标记抗体的常见荧光素有FITC,PE,APC、PerCP等,实验者可根据实验需求选择合适荧光素标记的抗体。流式细胞术测定胞内细胞因子实验亦应多多考虑抗体结合荧光素的选择[6]。例如,APC 和 PE 结合物通常会有最强荧光信号,可用于低表达水平细胞因子的检测。并为便于后续进行流式分析,尽量选用不同检测通道的荧光素抗体。
使用补偿微球对流式细胞仪进行电压和补偿调节。补偿微球通常比目的细胞小,在调节FSC/SSC电压和细胞设门时需要注意。
五、应用
细胞内细胞因子的检测在很多领域有着广泛的应用。以下简单举几个例子:
六、展望
随着现代⽣物行业的蓬勃发展,以及计算机技术、荧光染料、单克隆抗体、标记技术的不断进步,流式细胞术的检测能力必然会向更快速、更精确、更高效的方向发展。而基于人们对于自身健康水平的日益重视和科学家们对于更多疑难杂症的深入研究,从生物个体到细胞水平再到细胞因子等分子水平的研究方向也是必然趋势。相信在不久的将来,使用流式细胞术检测细胞内细胞因子可以在科研和临床医学领域有更多的突破。
参考文献
[1]朱彤波主编,医学免疫学 第2版,四川大学出版社,2017.02
[2]李静,阎景波,叶丽亚,等. 辅助性T细胞亚群两种测定方法的比较. 中华医学检验杂志, 1998, 21:7-8.
[3]Pietro PL, Tracy HL, Peter JM. Flow cytometrick measurement of intracellular cytokines[J]. Immunol Methods, 2000, 243: 107-124.
[4]钱莘, 施明, 王福生. 流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(S1):62-64.
[5]细胞内细胞因子的流式细胞仪检测. 生物在线.
[6]Lauer, F. T., Denson, J. L., Beswick, E., & Burchiel, S. W. (2017). Intracellular Cytokine Detection by Flow Cytometry in Surface Marker-Defined Human Peripheral Blood Mononuclear T Cells. Current Protocols in Toxicology, 73(1), 18.19.1–18.19.14. doi:10.1002/cptx.26
[7]Kagina, B. M., Mansoor, N., Kpamegan, E. P., Penn-Nicholson, A., Nemes, E., Smit, E., … Scriba, T. J. (2015). Qualification of a whole blood intracellular cytokine staining assay to measure mycobacteria-specific CD4 and CD8 T cell immunity by flow cytometry. Journal of Immunological Methods, 417, 22–33.