盐酸伐地那非基因毒性杂质肼的分析方法验证

杨玉萍 1 刘敏 2

1 三峡大学，湖北宜昌 443000 ；宜昌人福药业有限责任公司，湖北宜昌 443005 ； 2 宜昌人福药业有限责任公司，湖北宜昌 443005

摘要：盐酸伐地那非原料是我国化学制药业的一项药用原料，为了确保药品制造的质量安全，就必须要控制制药过程中杂质的水平，尤其应该重视针对盐酸伐地那非中基因毒性杂质肼的检验方法，确保准确地检测出杂质的含量水平，提高药品纯度。本文章探索过程中采用高效液相色谱法，利用柱效相似色谱来进行盐酸伐地那非基因毒性杂质肼的检验，色谱柱检测的波长为310nm，柱温为30℃，进样量为50微升，检测过程中的各项指标均符合实验规定。实验结果：该项方法适用于盐酸伐地那非基因毒性杂质肼的检测，在准确度与精密度等项目上都符合验收标准，可满足当前制药业的检测要求。

关键词：盐酸伐地那非；肼；杂质检测；高效液相色谱法

前言

制药企业在进行盐酸伐地那非原料的生产过程中可能会引入肼类杂质，而肼是已知的一种基因毒性杂质，对人体具有潜在性的致癌风险。所以制药企业在盐酸伐地那非原料生产的过程中，需要针对杂质肼进行充分研究与有效控制，来保障药品的质量安全。本文参考《中国药典》以及药品生产质量管理规范实施指南等书籍，对特定杂质肼含量检测方法进行分析方法学验证，以期对肼类基毒杂质的分析检测提供相关技术参考。

一、检测方法

色谱条件与系统适用性试验：采用Agilent Eclipse XDB-CN色谱柱，流动相为已烷-四氢呋喃（98：2），检测波长310nm，自动进样器温度10℃，柱温30℃，流速1.5ml/min，进样量50μl，检测器：VWD，质量标准中规定肼的限度为0.00225%。

溶液配制方法：

样品溶剂：甲醇-氢氧化钠溶液（称取氢氧化钠85g于1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度）（1：1）。

衍生化溶液：样品溶剂-苯甲醛（96：4），临用新制。

供试品溶液：取本品约50mg置25ml量瓶，加样品溶剂溶解（必要时超声）并稀释定容，精密量取4.0ml，置离心试管中，加衍生溶液2ml，摇匀，室温下放置2小时后，加入己烷2ml，快速振摇1分钟，3000rpm下离心3分钟，取上层溶液作为供试品溶液。

对照品溶液：取硫酸肼对照品约22.5mg至100ml量瓶，加样品溶剂稀释定容后取0.5ml至100ml量瓶，加样品溶剂稀释定容作为对照品贮备液。取对照品贮备液4.0ml至100ml量瓶，样品溶剂定容，按供试品同法处理，作为对照品溶液。

二、验证方法与结果

1.专属性

如前述方法分别配置空白溶剂、供试品溶液、对照品溶液、专属性溶液，检测对比HPLC图谱可知，空白产生的色谱峰对肼衍生物色谱峰无干扰；肼衍生物与相邻色谱峰分离度大于1.5。

1. 专属性色谱图

2.系统适用性

取对照品溶液连续进样6针检测，计算肼衍生物色谱峰峰面积RSD。结果显示，对照品溶液的峰面积RSD=2%（n=6）；肼衍生物理论板数大于2000，与相邻色谱峰分离度大于1.5。

3.线性

取对照品贮备液，分别精密量取适量不同浓度溶液，按供试品同法处理，作为各浓度项下线形溶液，结果如下：

1. 肼线性测试结果

结果：肼在浓度为0.000389μg/ml~0.02μg/ml范围内线性良好，线性方程为Y=59.986X+0.0084（r=0.9996）。

4.精密度

4.1.重复性

取本品①50.24mg②50.45mg③50.22mg④51.01mg⑤51.12mg⑥50.80mg分别置25ml量瓶，加对照品贮备液1.0ml，样品溶剂溶解并稀释定容，精密量取4.0ml，置离心试管中，加衍生溶液2.0ml，摇匀，室温下放置2小时后，加入己烷2.0ml，快速振摇1分钟，3000rpm下离心3分钟，取上层溶液作为重复性溶液。6份供试溶液中，肼衍生物含量极差0.00026%。

4.2.中间精密度

由另一名实验员在不同时间进行测定，方法同重复性，取本品①50.46mg②50.84mg③49.29mg④52.22mg⑤51.06mg⑥49.80mg分别置25ml量瓶，加对照品贮备液1.0ml，样品溶剂溶解（必要时超声）并稀释定容，精密量取4.0ml，置离心试管中，加衍生溶液2.0ml，摇匀，室温下放置2小时后，加入己烷2.0ml，快速振摇1分钟，3000rpm下离心3分钟，取上层溶液作为重复性溶液。

结论：12份供试溶液中，肼衍生物含量极差0.000125%，说明该方法精密度良好。

5.准确度

分别制备80%、100%、120%回收率溶液，回收率结果如下：

2. 肼衍生物回收率结果

结论：肼衍生物平均回收率97%，RSD=2%（n=9）。

6.定量限

肼衍生物定量限：取线性项下50%溶液6.7ml置100ml量瓶，稀释剂定容。

3. 肼衍生物定量限结果

结果：肼衍生物定量限浓度：0.000389μg/ml，峰面积RSD=2%（n=6）。

7.检测限

肼衍生物检测限：取线性项下50%溶液2.5ml置100ml量瓶，稀释剂定容。

结果：肼衍生物检测限浓度：0.000145μg/ml，信噪比①3 ②4 ③3。

8.溶液稳定性

取对照品溶液、供试品溶液分别10℃放置0、2h、8h、16h、20h、24h后进样，供试品溶液24小时无肼衍生物检出，对照品溶液各时间点对应检测值分别为（单位：mAu*min）：0.702、0.700、0.716、0.710、0.711、0.716，均值0.709，计算各峰面积RSD，考察溶液稳定性。

结论：溶液24小时内稳定；对照品溶液肼衍生物峰面积RSD=1%，对照品溶液24小时稳定性良好。

9.耐用性

取专属性溶液及对照品，如下表微调色谱条件，柱温30℃，每次改变一个条件，其它条件不变。

4. 耐用性研究

结果：专属性溶液肼衍生物含量RSD=7%，肼衍生物与相邻色谱峰分离度大于1.5。

三、结语

通过对盐酸伐地那非肼分析方法进行方法学验证，实验结果表明该方法的专属性、精密度、线性、准确度、溶液稳定性、耐用性均符合可接受标准，说明通过该方法对盐酸伐地那非肼测定可以得到准确、可靠的实验结果。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M]。北京：中国医药科技出版社，2020.

[2](2005) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, Q2 (R1), Geneva.http://www.ich.org/fileadmin/Pubic-web-site/ICH_products/guidelines/Quality/Q2-R1/step4/Q2-R1-Guideline.pdf

[3]缪德骅.药品生产质量管理规范实施指南 [M].北京: 化学工业出版社,2001:500.

作者简介：杨玉萍（1985-07），女，汉族，籍贯：湖北荆门，当前职务：副主任，当前职称：高级工程师，学历：本科，研究方向：药品研发