HPLC法测定依达拉奉潜在基因毒性杂质的研究

HPLC法测定依达拉奉潜在基因毒性杂质的研究

黄族威

海南合瑞制药股份有限公司，海南海口市 570311

[摘要] 目的 建立HPLC法测定依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯。 方法 色谱条件为：安捷伦液相1260；柱温：室温；流动相：流动相A：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3g，加水适量使溶解，加三乙胺1ml，加水至1000ml，摇匀，用磷酸调节pH值至4.5）；流动相B：乙腈；梯度洗脱；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm。 结果 本分析方法专属性、灵敏度、准确度均良好。 结论 该方法简便、准确，可用于依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯的检测。

[关键词] HPLC；依达拉奉；基因毒性杂质；联苯胺；硝基苯

依达拉奉是一种新型的脑保护剂，又是自由基清除剂。它主要用于改善急性脑梗塞的患者，所出现的神经症状，改善其日常生活能力和功能障碍。随着基因毒性杂质愈来愈备受关注，为了进一步研究本品可能潜在基因毒性杂质，本文建立了测定依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺、硝基苯的HPLC方法。

1、材料与方法

1.1试剂与仪器

甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

安捷伦液相1260；电子分析天平EX225DZH；pH计PB-10。

1.2方法

1.2.1色谱条件 参考本品的起始物料苯肼的有关物质检测方法：色谱柱：C18色谱柱；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3g，加水适量使溶解，加三乙胺1ml，加水至1000ml，摇匀，用磷酸调节pH值至6.8）-乙腈（75：25）；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm。在此基础上开发了本品的潜在基毒杂质检测方法。

1.2.2供试品溶液及对照品

取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为供试品溶液；取联苯胺、硝基苯对照品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含联苯胺与硝基苯各0.25µg的溶液，作为对照品溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相比例的选择

以水相为磷酸盐缓冲液（pH=6.8），有机相为乙腈，按不同比例进行配比作为流动相进行考察，结果如下表。

由结果显示，出峰顺序依次为依达拉奉峰、联苯胺峰、硝基苯峰，联苯胺峰较靠近依达拉奉峰，受依达拉奉拖尾峰干扰。其中，从联苯胺峰、依达拉奉峰保留时间来分析，比例为75：25的配比较佳。

2.1.2 流动相pH值的选择

由于继续调整流动相比例无法获得较理想的分离效果。另参考了本品的苯肼检查项下的分析方法（水相的pH值为4.5），在流动相比例为磷酸盐缓冲液-乙腈（75：25）的配比下，调节磷酸盐缓冲液的pH值进行考察，结果如下表。

由结果显示，联苯胺峰受磷酸盐缓冲液的pH值影响较大，当磷酸盐缓冲液的pH值为4.5时，基线较平，联苯胺与相邻杂质峰的分离度较大。

2.1.3 梯度洗脱程序的优化

由于硝基苯峰保留时间较长，为了缩短分析时间，以磷酸盐缓冲液（pH=4.5）为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序（见表1～3），进行考察，结果见表4。

表1：梯度洗脱程序1

表2：梯度洗脱程序2

表3：梯度洗脱程序3

表4：梯度洗脱程序优化考察结果

由表4结果显示，梯度洗脱程序3较佳。由于联苯胺可能受甲醇溶剂峰干扰，供试品溶液与对照品的制备方法修改为：取本品适量，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈3ml使溶解，并用流动相A稀释至刻度，制成每1ml中约含10mg的溶液，作为供试品溶液。取联苯胺、硝基苯对照品各适量，精密称定，加溶剂[流动相A-乙腈（70：30）]溶解并定量稀释制成每1ml中约含联苯胺0.06µg、硝基苯0.25µg的溶液，作为对照品溶液。代表性图谱见图1～2。

图1：对照品溶液色谱图

图2：50%准确度供试品溶液色谱图

2.1.4 色谱条件的确定

色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；柱温：室温；流动相：流动相A：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3g，加水适量使溶解，加三乙胺1ml，加水至1000ml，摇匀，用磷酸调节pH值至4.5）；流动相B：乙腈；洗脱梯度如表3所示；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm。

2.2 分析方法学验证

2.2.1定位试验与空白干扰试验

由试验结果可知：依达拉奉出峰时间为9.131min, 联苯胺出峰时间为4.043min, 硝基苯出峰时间为23.771min；溶剂、苯胺、苯肼、依达拉奉、苯酚均无干扰联苯胺、硝基苯的测定；联苯胺峰、硝基苯峰与相邻杂质峰的分离度均符合要求。

2.2.2 检测限与定量限

由试验结果可知：联苯胺的检测限为0.16ng，定量限为0.32ng，相当于样品浓度的0.81ppm和1.62ppm；硝基苯的检测限为0.63ng，定量限为1.26ng，相当于样品浓度的3.14ppm和6.28ppm。说明该方法的检测灵敏度高，满足使用要求。

2.2.3线性关系与范围

由试验结果可知：联苯胺浓度在8.07ng/ml～96.89ng/ml范围内，线性方程y = 0.0353x +0.0003，相关系数r =0.9996＞0.990；硝基苯浓度在31.40ng/ml～376.77ng/ml范围内，线性方程y = 0.0226x +0.2171，相关系数r =0.9994＞0.990；联苯胺、硝基苯的峰面积与溶液浓度均呈良好的线性关系。

2.2.4准确度

由试验结果可知：在50%、100%、150%准确度供试品溶液中，联苯胺的平均回收率分别为107.2%、107.6%、102.1%；硝基苯的平均回收率分别为94.0%、91.6%、95.7%，均在要求的80.0%~115.0%范围内。该方法的准确度良好。

2.2.5精密度试验

由试验结果可知：取同一批本品分别进行重复性试验和中间精密度试验，12组分析数据中，联苯胺、硝基苯含量的RSD%均<10，表明精密度良好。

2.2.6 耐用性试验

由试验结果可知：该检测方法的检测波长变化±2nm，流动相A pH值改变±0.05，以及同类型的不同色谱柱的耐用性均良好。

3 结论

本文建立了测定依达拉奉基因毒性杂质的HPLC方法，由方法学验证结果表明，该方法专属性、灵敏度、准确度均良好，可用于依达拉奉的潜在基因毒性杂质联苯胺与硝基苯的检测。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：374-377.

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