简介:摘要目的探讨脂多糖(LPS)刺激下NUFIP-1介导核糖体自噬在树突细胞(DCs)凋亡中的作用及意义。方法将培养的树突细胞系DC2.4分为空白对照组及LPS刺激6、12、24、48、72 h组(n=5),LPS各亚组加入1 μg/mL LPS培养相应时间。采用Western blot检测各组细胞NUFIP-1及自噬相关蛋白p62和LC3B表达水平,激光共聚焦显微镜检测NUFIP-1在细胞中的表达与定位及其分别与Lyso-tracker、LC3B共定位情况。将载有沉默空载体NS及沉默慢病毒载体NUFIP-1 siRNA感染DC2.4 (n=3),以1 μg/mL LPS刺激24 h,应用流式细胞分析术检测细胞凋亡情况,并采用Western blot检测凋亡相关蛋白包括胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)和Bcl-2表达水平。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD-t法进一步进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果Western blot结果提示,LPS刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后DC2.4中NUFIP-1蛋白表达水平呈现先升高后下降趋势,其中LPS 24 h组NUFIP-1表达水平显著高于空白对照组[空白对照组:(0.6786 ± 0.0820);LPS 24 h组:(1.4830 ± 0.1170),P<0.01]。同时,LPS 24 h组p62表达水平显著低于空白对照组[空白对照组:(0.9087 ± 0.1235);LPS 24 h组:(0.3113 ± 0.5571),P<0.01]。LPS 24 h组LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化显著高于空白对照组[空白对照组:(0.5542 ± 0.1248);LPS 24 h组:(2.5310 ± 0.3119),P<0.01]。激光共聚焦显微镜观察显示,NUFIP-1主要定位于细胞核及核周,LPS刺激后其荧光强度于6 h至24 h呈时间依赖性增强,而刺激48、72 h明显减弱。同时,NUFIP-1与Lyso-tracker及LC3B的共定位较空白对照组显著增强。采用慢病毒感染技术感染NUFIP-1 siRNA可显著下调DC2.4 NUFIP-1表达水平,与空白对照组及空载体组比较分析,差异有统计学意义[空白对照组:(0.6627 ± 0.1707);空载体组:(0.6966 ± 0.1107);siRNA组:(0.1428 ± 0.0296),P<0.05]。流式细胞分析术显示,NUFIP-1 siRNA感染组在LPS刺激后较空白对照LPS 24 h组及空载体LPS 24 h组DC2.4凋亡率显著升高[空白对照LPS 24 h组:(47.91%±1.006%);空载体LPS 24 h组:(70.26% ± 1.011%);siRNA LPS 24 h组:(80.23% ± 2.094%),P<0.01]。Western blot分析进一步证实,NUFIP-1 siRNA感染组相较空白对照组及空载体组在LPS刺激下DC2.4凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达显著增强[空白对照LPS 24 h组:(0.4748 ± 0.0876);空载体LPS 24 h组:(0.2849 ± 0.0418);siRNA LPS 24 h组:(0.9733 ± 0.0525),P<0.01],抗凋亡蛋白Bcl-2表达则明显下调[空白对照LPS 24 h组:(0.7810 ± 0.0490);空载体LPS 24 h组:(0.8292 ± 0.0729);siRNA LPS 24 h组:(0.3957 ± 0.0838),P<0.05]。结论LPS刺激后DC2.4中NUFIP-1介导核糖体自噬明显活化,且对DC2.4凋亡具有显著保护效应。
简介:目的初步探讨自噬在脂质诱导的肾小管上皮细胞损伤中脂质聚集中的作用。方法将HK-2细胞培养后,分为4组:0μg/m1组(A组)、20μg/ml组(B组)、50μg/ml组(C组)、100μg/ml组(D组)。分别用0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)刺激肾小管上皮细胞24h,用油红O法检测细胞内中性脂质,通过透射电子显微镜下观察自噬体形成,荧光显微镜下观察LC3-GFP融合蛋白示踪自噬形成,Westerblotting检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白。结果①油红O显示在0-100μ/ml浓度范围内LDL随浓度增高刺激细胞内脂质增多;②电镜显示正常HK-2细胞内可见少许自噬泡,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内自噬泡逐渐增多,但达到一定浓度(即100μg/ml)后自噬泡急剧减少;③正常HK-2细胞内可见少许LC3-GFP染色阳性,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内LC3-GFP染色阳性逐渐增多,但达到一定浓度即100μg/ml后LC3-GFP染色阳性急剧减少;④正常HK-2细胞内存在少量的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,但以LC3-Ⅰ为主,在0~50g/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均增加,但LC3-Ⅱ增加更明显,50μg/mlLDL组LC3-Ⅰ是0μg/mlLDL组的2倍,LC3-Ⅱ表达是0μg/ml的3倍,差异有统计学意义(均P〈0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增高,分别为0.41,0.82,1.23,差异有统计学意义(均P〈0.05),但LDL达到100μg/ml后LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均急剧减少,100μg/mlLDL组LC3-Ⅰ降至与0μg/ml组LDL相同(P〉0.05),LC3-Ⅱ表达降至为0μg/mlLDL组的1.5倍,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也急剧下降至0.52,差异有统计学意义(均P〈0.05)。结论肾小管上皮细胞内自噬与脂质有一定关系,自噬可能参与脂质诱导的肾小管上皮细胞内脂质聚集。
简介:[目的]探讨脂肝方对NASH肝细胞自噬、线粒体及其能量代谢的影响。[方法]将160只SD大鼠随机分为8组:8w正常组、8w模型组、12w正常对照组、12w模型对照组、西药对照组、脂肝方低剂量组、脂肝方中剂量组、脂肝方高剂量组,8w正常组及8w模型组在8w末处死,其余组大鼠均于12w末处死。正常组及模型组予生理盐水,给药组给药4周后取血用HLPC检测血清AMP/ATP比值,ELISA法检测血清AMPK含量,取肝脏组织用透射电镜观察各组大鼠肝细胞自噬及线粒体微结构改变。[结果]与12w模型对照组比较,西药对照组、脂肝方高剂量组、脂肝方中剂量组的AMP/ATP比值降低(P〈0.05),而AMPK含量升高(P〈0.05);用药组中,脂肝方高剂量组的AMP/ATP比值最低(P〈0.05),AMPK含量最高(P〈0.05)。透射电镜观察发现12w模型对照组大鼠肝细胞线粒体肿胀、空泡样变较8w模型组严重,线粒体自噬体较8w模型组增多;而用药组肝细胞线粒体结构受损程度较12w模型对照组明显改善,且自噬体较12w模型对照组减少,以脂肝方高剂量组改善最为明显。[结论]脂肝方能改善肝细胞能量代谢,防止线粒体损伤,激活AMPK,可能促进了线粒体自噬降解的快速完成,以减缓或阻止肝细胞炎症坏死的发生和加重,脂肝方对NASH有一定的防治作用。
简介:2016年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给了大隅良典。他是谁呢?大隅良典是日本东京大学的理学博士,他可是一个在行业里鼎鼎大名的人。诺贝尔奖颁发给他是由于他发现了细胞自噬的机制。细胞大家都知道,那自噬又是什么?让我们一一道来。
简介:摘要目的对成人噬血细胞综合征患者的骨髓噬血细胞形态进行分析,并探讨骨髓噬血细胞形态对成人噬血细胞综合征预后的临床意义.方法选取30例成人噬血细胞综合征患者作为研究对象,选取自2011年1月~2015年8月.对这30例成人患者的临床资料进行回顾性的总结分析,并对其实验室检查结果进行分析,观察其骨髓噬血细胞的形态.根据骨髓噬血细胞的形态,将这30例患者分为幼稚组和成熟组,对比幼稚组患者和成熟组患者的一般情况、血小板计数、白蛋白水平、死亡率.结果成人噬血细胞综合征患者的骨髓噬血细胞的形态呈不规则状,边缘呈撕裂样,包浆颜色较浅,每个细胞中有1~2个细胞核,细胞核形状不一,细胞核染色质呈疏松网状,细胞内吞噬数量不一.成熟组有12例患者,幼稚组有18例患者,与幼稚组相比,成熟组患者的年龄明显更大(P<0.05),其血小板计数、白蛋白水平均明显更低(P<0.05),死亡率明显更高(P<0.05).结论成人噬血细胞综合征的骨髓噬血细胞形态具有一定的特异性,骨髓噬血细胞的形态与成人噬血细胞综合征的预后效果有关,成熟形态的骨髓噬血细胞患者的死亡率较之幼稚形态更高.关键词成人噬血细胞综合征;骨髓噬血细胞;形态;预后中图分类号R551文献标识码A文章编号1008-6315(2015)12-1097-02
简介:摘要目的探讨家族性噬血细胞综合征(FHL)继发皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(SPTCL)的临床特点及基因突变情况。方法选取2012年6月河南省儿童医院收治的1例FHL继发SPTCL患儿为研究对象,回顾性分析其临床特征、疾病演变过程、基因突变及遗传学特点,并复习相关文献。结果患儿有UNC13D纯合突变伴STXBP2杂合突变,父母及兄长UNC13D为杂合突变。给予HLH-2004方案规律化疗,4年后疾病复发,二次化疗缓解1年后继发SPTCL,给予SMILE方案化疗后行异基因造血干细胞移植,至截稿前无病生存。结论对儿童噬血细胞综合征应及时完善相关基因检测,以明确原发病诊断。FHL可继发SPTCL,化疗联合异基因造血干细胞移植可能是目前唯一的治愈途径。
简介:摘要目的探讨内脂素对游离胆固醇(FC)过载血管平滑肌细胞(VSMCs)自噬及脂质代谢的影响。方法体外培养人主动脉VSMCs(CRL-1999),通过与甲基环糊精包被的胆固醇(Chol∶MβCD)共孵育构建VSMCs源性泡沫细胞模型,再结合酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)特异性阻断剂Sandoz58035,建立FC过载VSMCs模型。油红O染色及胞内胆固醇检测确定造模成功后,蛋白质印迹法(Western blot)检测自噬体膜蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的相对表达水平,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)-LC3的表达评估FC过载VSMCs模型的自噬水平。以不同浓度的内脂素(0、60、120、240 μg/L)作用48 h及240 μg/L的内脂素不同时间(0、12、24、48 h)作用于FC过载VSMCs,Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白的表达,转染GFP-LC3后,激光共聚焦显微镜下观察GFP-LC3的表达,计算绿色荧光点数,胆固醇检测评估胞内脂质代谢情况。多组间差异采用单因素方差分析,组间进一步两两比较采用LSD-t检验。结果FC过载VSMCs的LC3-Ⅱ蛋白的相对表达水平明显高于VSMCs源性泡沫细胞(0.32±0.06比0.21±0.03,t=3.875,P<0.05)和正常VSMCs(0.32±0.06比0.10±0.04,t=7.169,P<0.05),差异均有统计学意义;转染GFP-LC3的FC过载VSMCs胞浆中的绿色荧光点数明显高于VSMCs源性泡沫细胞[(71.34±7.79)个/细胞比(49.67±7.12)个/细胞,t=5.031,P<0.05]和正常VSMCs[(71.34±7.79)个/细胞比(12.10±3.41)个/细胞,t=17.100,P<0.05],差异均有统计学意义,FC过载VSMCs的自噬现象更为明显。此外,内脂素可呈浓度和时间依赖性抑制FC过载VSMCs内LC3-Ⅱ蛋白的相对表达水平,转染GFP-LC3后,内脂素可使FC过载VSMCs内的绿色荧光点数呈浓度和时间依赖性减少,而胞内的脂质沉积程度随着内脂素作用浓度及时间的增加而明显加重。结论内脂素可呈浓度和时间依赖性抑制FC过载VSMCs的自噬水平,并促进脂质沉积。
简介:摘要目的研究胰高血糖样肽-1受体激动剂(GLP-1RAs)对游离脂肪酸(FFA)诱导的肝细胞脂肪变性的影响,并探讨细胞自噬在该过程中的作用。方法体外人肝细胞培养诱导出非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型,加入浓度梯度的利拉鲁肽(LRG)观察其对细胞存活率和肝细胞脂肪变性的影响;用氯喹抑制细胞自噬,雷帕霉素(RAPA)激活自噬,探究利拉鲁肽改善肝细胞脂肪变性与细胞自噬的关系。实验分组:对照组,DMEM完全培养基培养的细胞中加入一定浓度BSA;FFA模型组,用1 mmol/L的FFA(OA∶PA=2∶1)诱导肝细胞脂肪变性;LRG组,细胞中同时加入FFA(1 mmol/L)和LRG(100 nmol/L);自噬抑制组,细胞中同时加入FFA(1 mmol/L)、LRG(100 nmol/L)和氯喹(20 μmol/L);自噬激活组,细胞中同时加入FFA(1 mmol/L)和RAPA(1 μmol/L)。用油红O染色、全自动生化分析仪观察肝细胞内脂质沉积情况,蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白(Beclin1、P62、LC3B)水平,观察细胞自噬水平。多组间均数比较用单因素方差分析。结果在一定浓度范围内,随着LRG浓度的增加,肝细胞存活率不断上升,胞内脂质沉积程度不断减轻,LRG浓度达到100 nmol/L时效果最佳,且与FFA组相比差异有统计学意义(P < 0.01)。在肝细胞脂肪变性程度与细胞自噬关系的探究中,LRG组肝细胞内甘油三酯含量显著低于FFA组(P < 0.01),Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平较FFA组升高,P62水平较FFA组下降,细胞自噬增强;自噬抑制组与LRG组相比,胞内甘油三酯含量有所增高(P < 0.01),Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平下降,P62水平增高;自噬激活组中RAPA显著减轻了FFA诱导的肝细胞内甘油三酯沉积,自噬相关蛋白水平变化与LRG作用效果一致。结论GLP-1RAs可以改善FFA诱导的脂毒性肝细胞损伤,并通过促进细胞自噬来改善NAFLD中肝细胞脂肪变性。
简介:摘要目的探讨大黄素在D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肝损伤中的保护作用及其机制。方法将40只BALB/c雄性小鼠按随机数字法分为5组(n=8),对照组、大黄素组、D-GalN/LPS组、大黄素+ D-GalN/LPS组和自噬抑制剂3-MA+大黄素+ D-GalN/LPS组。经小鼠腹腔注射D-GalN (700 mg/kg)/LPS (10 μg/kg)诱导急性肝损伤模型。3-MA(15 mg/kg)和(或)大黄素(20 mg/kg)腹腔注射于模型建立前30 min,6 h后在麻醉下处死小鼠并采集血、肝组织标本。采用比色定量法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、肝组织髓过氧化物酶(MPO)活性,采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的水平,HE染色观察肝组织病理学改变,Western blot检测肝组织自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达量,并分析实验动物生存率。定量资料比较采用单因素方差分析,采用SNK-q检验进行两两比较,方差不齐时采用Games-Howell检验。结果与对照组相比,D-GalN/LPS组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[(2 476.80±263.14)U/L、(271.71±47.15)U/L、(537.92±89.35)pg/mL、(169.74±25.52)pg/mL、(1.37±0.22)U/mg]显著升高(P<0.05)。与D-GalN/LPS组相比,大黄素+D-GalN/LPS组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[(1 248.01±380.70)U/L、(142.59±34.63)U/L、(288.91±67.21)pg/mL、(61.83±13.64)pg/mL、(0.80±0.21)U/mg]显著降低(P<0.05)。与D-GalN/LPS组相比,大黄素+D-GalN/LPS组可明显减轻肝组织肝细胞的病理损伤,提高小鼠生存率。与对照组相比,D-GalN/LPS组肝组织LC3-Ⅱ、Beclin1表达下降;而与D-GalN/LPS组相比,大黄素+ D-GalN/LPS组肝组织LC3-Ⅱ、Beclin1表达升高。联合自噬抑制剂3-MA后大黄素的肝保护效应被逆转,AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[(2 398.78±233.57)U/L、(242.79±43.46)U/L、(505.07±67.89)pg/mL、(151.46±14.11)pg/mL、(1.27±0.15)U/mg]升高(P<0.05),肝组织病理损伤加重。结论大黄素减轻D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤,这可能与激活LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白恢复自噬有关。