简介:目的:通过对TRIzol一步法进行改进,建立一种从富含胶原蛋白、多糖及色素的仿刺参体壁提取总RNA的有效方法。方法:样品在液氮中研磨并用TRIzol匀浆后再进行抽提;对TRIzol一步法提取的总RNA进行DNaseⅠ消化和酚氯仿抽提,用2.5mol/L的醋酸钾沉淀,并加入适量糖原(10mg/mL)与RNA共沉淀。结果:琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法以及RT-PCR检测结果表明,改进的方法能够有效去除基因组DNA、蛋白、多糖及色素的污染,RNA的产率提高。结论:制备的总RNA纯度高,完整性好,能够满足mRNA差异显示RT-PCR等分子生物学研究的要求,是一种提取仿刺参体壁及其他富含黏多糖、胶原蛋白和色素的动物组织总RNA的有效方法。
简介:目的:从航天诱变向日葵种子中提取高质量的总RNA。方法:采用改进的SDS法,提取缓冲液与氯仿同时作用液氮研磨材料后,用酸酚-氯仿抽提一次,经LiCl过夜沉淀、DNaseⅠ处理、1/2体积的无水乙醇沉淀多糖,最后加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀总RNA,用琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度法测定产量与纯度,用PT-PCR鉴定RNA的质量。结果:提取的RNA电泳条带清晰,D260nm/D230nm、D260nm/D280nm值分别为2.09、2.00,其产量为35.30μg/100mg,用PT-PCR能扩增出肌动蛋白基因片段。结论:采用该方法提取的总RNA纯度高、完整性好,适于进一步的分子生物学研究
简介:目的:建立北京株水痘疫苗生产工艺,采用此生产工艺生产水痘减毒活疫苗。方法:采用细胞工厂培养2BS细胞,感染北京株水痘-带状疱疹病毒工作种子批,同时感染Oka株水痘-带状疱疹病毒工作种子批作对照,经洗涤、离心、收获、原液合并、冻干制备水痘减毒活疫苗,并进行各项检定。结果:对照两种不同毒株生产的水痘减毒活疫苗无明显差异,且各项检测指标均符合要求。结论:根据结果显示,可使用此毒株生产工艺大规模生产北京株水痘疫苗,与Oka株生产水痘疫苗无差异。如果用此毒株生产水痘疫苗供应市场,将会打破Oka株水痘疫苗国内市场的垄断。
简介:目的:在FUS-50L生物反应器中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株,生产重组颗粒溶素(GNLY)。方法:选取含pET28a(+)-GNLY的BL21(DE3)pLysS菌株单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于发酵罐中。在发酵过程中,控制溶氧为30%~50%,温度为37℃;在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到11h;加入葡萄糖至终浓度为1%,30℃诱导表达6h;收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western印迹检测重组蛋白的抗原性,用CFU方法检测其生物学活性。结果:发酵液中最终菌体密度达80g/L;纯化所得重组蛋白约占菌体总蛋白的5%,含量为60mg/L;经鉴定所获重组颗粒溶素有较好的免疫学活性和生物学活性。结论:用含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统,可得到具有生物活性的重组颗粒溶素,为大批量生产提供了条件。
简介:目的:建立一种简便的对抗体相对亲和力进行定性比较的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,以便快速、简便地从大量抗体突变体中挑选高亲和力突变体。方法:将待测抗体倍比稀释后用直接ELISA方法进行定量,同时用相同浓度抗体作为一抗与抗原进行间接ELISA反应,以前者吸光度值为横轴、后者吸光度值为纵轴绘制散点图,通过拟和后的曲线判断抗体亲和力高低,并通过BIA-core法对该方法的准确性进行验证。结果:通过该方法获得的抗体亲和力高低情况与经测定抗体亲和力得出的结果一致。结论:该ELISA方法是一种简便可行、准确有效的抗体亲和力定性比较方法,可以应用于不同抗体的亲和力成熟比较研究。