陈旧骸骨DNA身份鉴定的法医学进展

陈旧骸骨DNA身份鉴定的法医学进展

向婷 汪林

四川福森特司法鉴定所 四川 610041

四川基因格司法鉴定中心 四川 610041

【摘要】骨骼及牙齿作为重要的生物样本，因结构特殊往往抗降解能力强，成为自然条件下保留DNA理想生物材料。鉴定历史人物案例过程中，陈旧的骨骼及牙齿样本作为唯一的生物检材，由于时间久远，在内部含有微量DNA，需要经过特殊的实验处理进行身份鉴定。本文就对相关研究报道展开总结与分析，为陈旧骸骨DNA检测体系发展提供合理依据。

【关键词】陈旧骸骨；DNA；鉴定；法医遗传学

牙齿及骨骼组织自身结构特殊性，往往抗腐败能力较强，目前在诸多复杂案例当中，如对于历史人物鉴定、失踪人员调查以及重大灾难处理等，成为用于DNA分析的唯一生物材料。DNA检验作为明确未知名尸骨身份确认的金标准[1]，目前在法庭科学实践当中，对于完整的尸骨大多推荐股骨、牙齿等进行检验，一方面具有取材便捷优势，利用手锯、拔牙钳即可完成，另一方面在陈旧尸骨当中，长骨以及牙齿的自然特点及钙化结构下能利于保留DNA。通常情况下，在牙齿及骨骼检材的DNA鉴定步骤当中，主要为取材与研磨、脱钙、裂解，DNA纯化与定量，扩增及片段分析[2]。但目前应用于实际检案时，死亡间隔数年甚至数十年的骨骼及牙齿在发掘过程中，由于长久暴露在外界复杂环境中，在陈旧骸骨当中含有的DNA量极少，且高度降解、严重污染及抑制因素干扰等均影响到DNA鉴定。文章就对DNA提取、DNA富集及检测分析方面展开综述，现报道如下。

1.骨骼选材

合适的取材部位成为检验陈旧骨骼DNA的第一步。骨骼及牙齿的钙化结构中因增加对DNA降解外源因素抵抗力，而钙化程度往往决定DNA检验成功率，目前，长骨特别是股骨中致密的皮质骨，被认为是当前首选的人类遗骸鉴定操作指南的样本。近20年来，长骨被作为陈旧骨骼身份鉴定的DNA来源已然作为法医学领域共识。随着各类疑难案例当中陈旧骨骼样本鉴定需求增加，在陈旧骨骼当中，DNA高度降解、严重污染成为常见问题。为此，人类颞骨岩部被作为鉴定检材，逐渐被法医学界引入与尝试。古代DNA研究表明[3]，颞骨岩部为人体致密的骨骼之一，各类陈旧骸骨中能获得较高的DNA。目前在陈旧性骸骨检材的选择之中，首选的股骨、胫骨等承重骨的皮质部位进行DNA提取。对于有完整颅骨检材时，采集颞骨岩部为一项值得推荐的选择。

2.DNA提取

骨细胞、成骨细胞及破骨细胞为组成人类骨骼主要组织，细胞间质则为胶原、羟基磷灰石构成，胶原能占据骨质量30%，羟基磷灰石约占据骨干质量65%~75%。而骨组织抗腐败降解能力强，高度钙化会增加骨组织DNA回收难度。在理想骸骨DNA提取过程中，主要是消耗少量骨粉能获取高质量DNA[4]。为此，在提取DNA过程中，减少及简化提取步骤，避免进一步降解与污染DNA，实现快速、高效、简便及纯净的DNA提取。目前在骨骼内DNA提取之中，主要分为以下三个步骤：去矿物质、裂解和纯化。去矿物质又被称之为脱钙，基于一个前提，DNA被紧密结合在密集的骨结晶聚合体中，未经过脱钙处理，此时DNA并不会被释放在溶液之中。当样本脱钙经蛋白酶裂解K裂解后，释放DNA，经过滤柱、磁珠纯化回收DNA。

3.DNA修复

目前在对死亡年限超过50年的陈旧骸骨的DNA检测中发现，大规模平行测序技术检测低水平变异频率中呈阈值降低，这会影响到遗传标记检测。通过修复损伤DNA能获得良好检测结果，并有助于帮助结果解释，能节省样本和反复实验产生的消耗成本[5]。目前在提取陈旧骸骨DNA中，其关键为降低污染及最大程度回收DNA。样本条件差时，取0.5~1g骨粉单次提取后，在进行完全脱钙处理，能释放出残余DNA，经柱提法活磁珠法纯化回收。出现样本数量众多且保存条件尚可时，利用PrepFiler TM BTA法医 DNA提取试剂盒，骨粉投入量较小，与磁珠法结合应用后，能实现批量自动化提取，效率高。经DNA修复处理后，一定程度能提高对某些高损伤DNA鉴定结果质量，可用于陈旧骨骼DNA个体识别鉴定。

4.目标片段分析方法

片段分析和序列分析作为识别陈旧骸骨个体鉴定的常见方式。片段分析为特定遗传标记检测，常见为STR、miniSTR、SNP 等，序列分析则是经测序获得样本中部分及全部序列信息，如Sanger测序mtDNA高变区序列。目前在陈旧骸骨内源性中DNA数量受限，且伴随着DNA降解及损伤，为获取足够可信的DNA分型数据，在检测前需要富集目标DNA片段。在常用的DNA片段富集方法中，包括多重PCR技术及杂交捕获技术。多重PCR技术能实现扩增成百上千条特定序列，高效利用有限的DNA，在使用中可兼容多重遗传标记，广泛用于高度降解DNA。自2021年来多项陈旧骸骨鉴定研究中，采取美国Thermo Fisher Scientific公司推出的六色荧光标记试剂盒GlobalFiler TM PCR扩增试剂盒，含有所有DNA联合索引系统基因座、欧洲常用STR和10个miniSTR，具有全球DNA数据库兼容性，包括专门针对降解DNA、痕量DNA及低水平DNA样本。mtDNA因拷贝数量多，结构稳定以及高突变区变异频率高，作为微量、高度降解骸骨及牙齿样本常见的遗传标记。mtDNA因具备母系遗传特点，常常与STR、SNP遗传标记联合使用，能具有排除及不排除母系关系的作用。鉴定应用中，通常扩增及测序mtDNA的高变区I、HVII2个片段，可获得满意成效。mtDNA具有较高灵敏度，实验之中则需要创建完整防污染系统，保证实验区域的绝对清洁，完善人员防护。

下一代测序技术（NGS）可对STR基因座的长度多态性及序列多态性同时检测，兼容STR、SNP多种遗传标记，能测序多个样本，提高鉴定效率。当前，常见的试剂盒为美国 Verogen公司推出的 ForenSeq TM DNA Signature Prep，能用于测定230个基因座，涵盖27个常染色体STR等，且绝大多数基因座产物长度小于200bp，适用于陈旧骸骨及牙齿高度降解样本鉴定。

5.小结

    随着对陈旧骸骨DNA检测技术的不断探索及完善，可检测骨骼类型愈加丰富，大大提高了DNA回收量及回收率。目前陈旧骨骼鉴定中长骨样本成功率高，提取DNA时能保证完全钙化，减少液体转移步骤，利于DNA回收。在分析陈旧骸骨DNA中，如何把握分型结果准确性尤为重要。在陈旧骸骨的DNA分型图谱当中，可能存在微生物引入的伪峰，DNA高度降解且为痕量，测序会出现次要等位基因未达到阈值的假阴性现象等。为此，则需要合理选择DNA检测方式，保障结果准确性。

参考文献

[1]吴雅兰,贾霄,陈灿球. 改良硅珠法检出19年血刀上陈旧血痕DNA分析1例[J]. 广东公安科技,2021,29(2):68-69.

[2]金鑫,苏建富,王亚萍. DNA二代测序技术在30年陈旧骨骼检验中的应用[J]. 刑事技术,2023,48(6):645-648.

[3]罗亚,黄江,梁芹,等. 陈旧性骨骼DNA提取方法的探索[J]. 中国法医学杂志,2016,31(1):78-80.

[4]宋振,宋三平,凃政,等. 两种提取骨骼、牙齿DNA的方法[J]. 刑事技术,2018,43(1):39-42.

[5]杨子豪,蒋志伟,吴黎明,等. 不同部位骨骼预处理及DNA提取方法的比较研究[J]. 中国司法鉴定,2023(1):63-70.