浅谈动物实验检测中的荧光PCR技术

浅谈动物实验检测中的荧光PCR技术

阳红莲

西藏林芝市农业农村局畜牧兽医站 860000

摘要：本文旨在介绍荧光定量PCR技术，并详细说明了其使用前的准备工作、操作流程和注意事项，为广大动物实验爱好者提供参考。

关键词：动物实验检测 PCR技术

荧光PCR技术，也称为荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR,RT-PCR），是一种在动物实验室检测中广泛应用的分子生物学技术。

首先，荧光PCR技术能够快速、准确地检测动物样品中的DNA或RNA水平，尤其是病原体，如病毒、细菌和其他微生物。这是因为荧光PCR技术可以根据病原体的特性序列选择特异性探针，并在PCR试剂盒中添加其他必要成分，然后在特定的温度和时间范围内进行反复扩增。这种技术能够检测到低浓度的病原体，有效提高检测速度和准确性。其次，荧光PCR技术具有高灵敏度，能够以少量样品快速、准确地检测出病原体定量。此外，由于其试剂、耗材和仪器成本相对较低，荧光PCR技术可以有效地节约检测成本。

在动物实验检测中，荧光PCR技术不仅被用于检测动物的传染病毒及相关疾病，还可用于检测其他病原体。通过结合使用芯片技术和其他技术，荧光PCR技术可以快速、准确地检测出动物疫病的潜伏期及其传播情况。

1．检测前的准备工作

PCR实验检测前的准备工作是确保实验顺利进行和获得可靠结果的重要前提。

1．1 实验器材准备

在实验开始前，需要准备好PCR仪、移液器、离心机、电泳仪等必备的实验器材，并确保其性能良好、准确可靠。同时，需要准备好实验所需的耗材，如PCR管、吸头、凝胶等。

1．2试剂准备

PCR实验所需的试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、引物等，需要注意试剂的质量和有效期，并按照实验要求进行配置。同时，需要注意试剂的储存条件和使用方法，以避免影响实验结果。

1．3操作环境准备

PCR实验对操作环境的要求较高，需要保证实验室的清洁和消毒条件。实验室的温度、湿度和尘埃颗粒数等环境因素也需要控制在适宜的范围内，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1．4实验设计

在PCR实验前，需要进行充分的实验设计，包括确定目标基因、引物设计、样本选择、实验条件等方面的内容。在实验设计中，需要遵循科学性和可行性原则，同时需要考虑可重复性和可扩展性等因素。

1．5样品准备

PCR实验所需的样品可以是基因组DNA、cDNA或其他相关生物样品。在准备样品时，需要注意样品的纯度和浓度，并避免样品被 污染或交叉污染。同时，需要选择适当的样品处理方法，以获得高质量的DNA模板。

1．6操作人员培训

PCR实验对操作人员的技能和经验要求较高，需要进行专业的培训和指导。操作人员需要熟悉PCR实验的基本原理、操作流程和注意事项，并能够熟练操作实验器材和仪器。同时，操作人员需要具备严谨的科学态度和良好的实验习惯，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1．7实验计划制定

在PCR实验前，需要制定详细的实验计划，包括实验目标、操作流程、时间安排、质量控制等方面的内容。通过制定实验计划，可以合理安排实验资源和时间，提高实验效率和质量。同时，实验计划可以为后续的数据分析和结果解释提供依据。

1．8质量控制

在PCR实验中，质量控制是保证实验结果闪、准确性和可靠性的关键环节。质量控制包括对实验器材、试剂、环境、样品和操作过程等方面的监控和管理。通过建立完善的质量控制体系，可以及时发现和解决潜在问题，提高实验结果的准确性和可靠性。同时，质量控制也可以提高实验室的声誉和竞争力，为实验室的长远发展奠定基础。

2．操作流程

2．1 样品处理

在进行荧光PCR反应之前，需要确保样品的正确处理。根据所检测的样本类型，选择合适的处理方法，例如血液、组织、细胞等。在处理过程中，要确保样品的纯净度，避免污染和交叉污染。

2．2 引物设计

引物是荧光PCR反应中的关键因素，设计引物时需注意以下几点：

2．2．1 引物长度：通常在18-30bp之间，过短影响特异性，过长可能导致非特异性扩增。

2．2．2 引物序列：避免在引物内部存在连续的重复序列，这可能引起引物二聚体。

2．2．3 引物特异性：确保引物能特异性地与目标模板结合，避免与基因组其他区域或其他物种的基因发生非特异性结合。

2．2．4 引物GC含量：通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能影响PCR反应。

2．3 配置反应体系

PCR反应体系包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs等基本成分，以及其他必要的辅助试剂和缓冲液。根据实验条件和要求，可以添加一些其他试剂，如离子抑制剂、蛋白质稳定剂等。反应体系的配置应该在无菌条件下进行，以避免污染。

2．4 基因组DNA模板加入

将处理好的基因组DNA模板加入到准备好的反应体系中，通常使用微量移液器将DNA模板加入到PCR管中。在加入DNA模板时，要保证加入的量准确，并避免引入污染。

2．5 PCR仪进行扩增

将配置好的PCR反应混合物放入PCR中，按照设定的程序进行扩增。PCR仪可以自动控制温度和时间，完成变性、退火、延伸等步骤，从而扩增目标DNA片段。在扩增过程中，要保持稳定的温度和时间条件，以保证扩增的准确性。

2．6 电泳检测扩增产物

PCR扩增完成后，通过电泳技术检测扩增产物。电泳技术可以将不同大小的DNA片段分离，通过染色或荧光标记等技术进行检测。在电泳检测中，要选择适当的凝胶浓度和电泳条件，以保证分离效果和检测的准确性。

2．7 荧光检测

在PCR扩增过程中，荧光染料会被嵌入到新合成的DNA链中，通过荧光检测系统检测荧光信号。荧光信号的强弱与扩增产物量呈正相关，可以用于定量分析。

2．8 结果分析

根据荧光检测系统所得的数据，进行分析和解读。通过对比已知阈值和样本的阈值循环数（Ct值），判断样本中目标基因的表达量。同时，可以结合其他生物学数据，对实验结果进行分析。

2．9 重复实验

为了保证实验结果的可靠性和准确性，需要进行重复实验。通常需要进行至少两次重复实验，以排除偶然误差和异常值的影响。在重复实验中，需要注意保持实验条件的一致性，包括试剂、仪器、操作等环节的一致性。

2．10 数据分析

对所得的数据进行统计分析，包括描述性统计、方差分析、回归分析等方法，以探究样本间的差异性和关联性。分析结果可以用于判断目标基因表达的相关因素和影响机制。

2．11 实验记录

在实验过程中，需要详细记录每个步骤的操作和结果，包括样品处理、引物设计、反应液配置、扩增程序、荧光检测结果等。实验记录是实验结果的重要依据，有助于保证实验的准确性和可重复性。同时，实验记录也有助于对实验过程进行追溯和质量控制。

3.注意事项

在荧光定量PCR操作中，需要特别注意以下事项：

3．1 实验室的分区要明确，包括试剂准备间、样本处理间、PCR室、电泳间等。不同区域的实验室的实验服不能混用。

3．2 在试剂准备和样本处理区域，不能处理实验相关的高浓度的核酸模板，如高浓度的标准品、PCR产物、miRNA的miniCS等。

3．3 为了减少污染的风险，应尽量减少频繁多次走去动，尤其是去过电泳间后，当天不应进入其他实验室。

3．4 使用生物安全柜进行加样操作，确保移液器的清洁，不同位置的移液器不可混用，避免污染。

3．5 在检测体系中添加UNG本系酶系统，以避免PCR产物的污染。

3．6 对每批次配剂或购买的试剂进行质检，确保试剂性能稳定、可控和均一。

3．7 试剂使用前必须进行混匀。

3．8 使用移液器时，使用结束后应调整至大量程，取样时枪头应深入液面1-2mm，避免外壁沾上过多试剂随加样进入导致重复性不好。

3．9 加样时要使用合适量程的移液器，对于较小体积的移液器，取液时不可深入液体太多，以免试剂沾到吸头外壁导致移液量不准确。

3．10 反应液分装前必须混匀，第一个分装时应润一下枪头。加样时要保持一定的顺序，并确保所有孔的加样方式相同，以减少误差。

3．11 按照实验步骤进行PCR反应循环，注意控制温度和时间。

3．12 在PCR实验过程中，应遵循实验室的安全规定，避免交叉污染和安全事故。

通过这些注意事项，可以有效地保证荧光定量PCR实验的准确性和可靠性。同时，也要注意遵守实验室的规章制度和操作流程，确保实验过程的安全性。

参考文献：

1．赵婷婷，王志亮，张秀丽等．荧光定量PCR技术在动物疫病诊断中的应用【J】．中国动物检疫，2019，36（6）：33-37

2．张倩倩，胡志强等．荧光定量PCR技术在动物食品中的应用【J】．食品研究与开发，2019，40（15）;27-32

3.王彩霞，李卫中，吴昊等．荧光定量PCR技术在动物病毒检测中的应用【J】．动物医学进展，2019，40（6）：74-79