miR-520e-3p、miR-9-5p对非小细胞肺癌的调控功能

miR-520e-3p、miR-9-5p对非小细胞肺癌的调控功能

张存喜1   丁浩2*张琪2王梦迪2朱璇2

1. 镇江市第一人民医院新区分院 普外科，江苏 镇江，212132；
2. 镇江市第一人民医院 呼吸科，江苏 镇江，212002

摘要：目的：探讨miR-520e-3p、miR-9-3p在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中的生物学作用。方法：通过生信方法、qRT-PCR分析miR-520e-3p、miR-9-5p在NSCLC中的表达情况，使用MTT、克隆形成、Transwell和划痕愈合实验检测miR-520e-3p、miR-9-5p对NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果：在NSCLC中，miR-9-5p高表达，miR-520e-3p低表达，过表达miR-9-5p能促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力；过表达miR-520e-3p能抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论：miR-9-5p促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，miR-520e-3p的功能则相反。它们是NSCLC中潜在治疗靶点。

关键词：miR-520e-3p；miR-9-5p；非小细胞肺癌；调控

非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌。尽管目疗前有多种治疗方案，但NSCLC患者的总生存率仍较低1。因此，仍需要进一步阐明NSCLC的分子机制。miRNA是一类非编码RNA，可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生发展2；例如，miR-520e可调节乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移。但是miR-520e-3p和miR-9-5p在NSCLC中仍需要进一步验证。

1材料与方法

1.1材料

BEAS-2B、A549、SK-MES-1和H1299购自中国浙江美森科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM培养基、MTT、DMSO、小室、二氧化碳培养箱、显微镜购自美国赛默飞世尔科技公司；miR-9-5p和miR-520e-3p模拟物、miR-9-5p和miR-520e-3p抑制剂、阴性对照和引物购自中国Gene Pharma公司；Lipofectamine 2000、Trizol试剂、Superscript II试剂盒、SYBR Green Supermix购自美国Invitrogen公司；AB7500购自美国Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染

BEAS-2B、A549、SK-MES-1和H1299细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。置于CO2培养箱中培养。按照操作说明，使用Lipofectamine 2000试剂将合成的序列或抑制剂转染到A549细胞，转染48 h后收集细胞。

1.2.2提取RNA和qRT-PCR

采用Trizol试裂解细胞，提取总RNA。使用Superscript II试剂盒逆转录获得cDNA，使用SYBR Green Supermix在ABI 7500系统上进行qPCR检测。U6用作内部参照。数据用2-ΔΔCt方法分析表达。

1.2.3增殖实验

将转染后的细胞以1000细胞/孔的密度接种于96孔板。添加20μl MTT到每个培养孔，孵育4h后去除上清液，每孔加入150μl DMSO。在570nm处测定各孔的吸光度值。

1.2.4划痕愈合和侵袭

在单层细胞中央划线并去除划下的细胞。在显微镜下记录0 h和24 h的划痕愈合图像。使用不含血清的培养基将2.5×104个细胞接种于预涂基质胶的小室中，将含血清的培养基加到下室，培养24 h后。用多聚甲醇固定，结晶紫染色。在显微镜下拍照。

1.2.6统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 8.0版本进行。实验结果表示为平均值±标准差。两组间单因素比较由Student’s t检验进行分析。* p<0.05被认为具有统计学意义。

2结果

2.1miR-9-5p和miR-520e-3p在NSCLC中异常表达

对TCGA数据库和GEO数据库中NSCLC的miRNA表达量进行生信分析，结果显示miR-9-5p表达上调，miR-520e-3p表达下调（图1A-B），qRT-PCR检测结果显示，miR-9-5p和miR-520e-3p在NSCLC细胞系中的表达与生信分析结果一致（图1C-D）。

图1 miR-9-5p和miR-520e-3p 在NSCLC中表达情况

2.2 miR-9-5p、miR-520e-3p对NSCLC细胞的影响

qRT-PCR检测个各转染组A549细胞系的结果显示，转染后两个miRNA表达发生明显变化（图2A）；MTT、Transwell和划痕愈合实验结果显示，过表达miR-9-5p增强A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制miR-9-5p则相反，过表达miR-520e-3p抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制miR-520e-3p则相反（图2B-D）。

图2 miR-9-5p和miR-520e-3p对NSCLC细胞的影响

3 讨论

miRNA异常表达与NSCLC进展有关；本研究显示在NSCLC中miR-9-5p在显著上调和miR-520e-3p显著下调，过表达miR-9-5p以及抑制miR-520e-3p均能增强NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。推测miR-9-5p和miR-520e联合诊断的价值远大于二者单独使用进行诊断。本研究证实了在NSCLC中miR-9-5p起促癌作用，miR-520e-3p起抑癌作用，但仍不清楚二者调控NSCLC分子机制，这需要后续进一步深入研究。

参考文献：

1Herbst, R. S., Morgensztern, D. & Boshoff, C. The biology and management of non-small cell lung cancer. Nature 553, 446-454, doi:10.1038/nature25183 (2018).

2Sun, C. C., Li, S. J. & Li, D. J. Hsa-miR-134 suppresses non-small cell lung cancer (NSCLC) development through down-regulation of CCND1. Oncotarget 7, 35960-35978, doi:10.18632/oncotarget.8482 (2016).

基金：1.2020年江苏省高层次卫生人才“六个一工程”拔尖人才项目 （LGY2020063）
2020 Jiangsu Province High Level Health Talents “Six One Project”Top Talent Project                                                   
2.2021年度镇江市科技创新资金（重点研发计划——社会发展）项目 （SH2021049）
2021 Zhenjiang City Science and Technology Innovation Fund (Key R&D Plan - Social Development) Project                                          
3.2021年度镇江市“金山英才”高层次领军人才培养计划（2021-169DT-20）
2021 Zhenjiang City “Jinshan Talent”High Level Leading Talent Training Plan；