束缚应激结合慢性不可预知温和应激（CUMS）损伤小鼠

束缚应激结合慢性不可预知温和应激（CUMS）损伤小鼠

卵母细胞发育能力的研究

 刘鑫坤 郭寒姝 左柏伊 隋宏书 王俞杰

（1.山东第一医科大学临床与基础医学院，济南 2..山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系，济南）

【摘要】 目的 探究束缚应激结合慢性不可预知性温和应激（）影响小鼠卵母细胞发育能力的机制。方法选取20只雌性KM小鼠，遵循随机原则，划分为慢性不可预知性温和应激组（CUMS组）、束缚应激组（WRS组）、慢急性联合应激组（CACS组）、对照组等4组，每组5只。CUMS组每日随机使用一种或多种不可预知性温和应激。WRS组前三周小鼠正常饲养，后将小鼠置于适宜大小的细铁丝笼子中进行束缚应激处理。CACS组前三周刺激同CUMS组，刺激结束1天后立即给予束缚应激同WRS组。建模成功后，麻醉小鼠取双侧卵巢以获取卵母细胞，并计数；卵母细胞体外成熟后激活，计算激活率；获得原核胚继续培养，观察记录2-细胞、囊胚的发育情况，对囊胚细胞数进行记录。结果在超排后卵母细胞获卵数、囊胚形成率上，相较对照组，应激组有显著降低；在卵母细胞体外成熟率上，应激组也有降低。结论束缚应激结合慢性不可预知温和应激可损伤小鼠的卵母细胞发育能力。

关键词：束缚应激；慢性不可预知温和应激；卵母细胞；囊胚；

中图分类号: Q813.7            文献标识码：A

第一作者：刘鑫坤，2020级临床医学本科专业在读本科生

通讯作者: 王俞杰， E-mail:2579728429@qq.com，

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2022104391062）

1. 前言

作为人类日常生活中影响身体健康的因素之一，急性心理应激十分常见。应激对女性生殖能力的影响较大，尤其是影响卵母细胞的发育能力。当今社会，生活节奏的加快和压力的增加以及各种不可控事情的发生，应激发生的频率也日渐增多。心理应激，是在对外界环境中的有害物、威胁等产生评价、认知后，在行为、生理和心理上，个体作出的反应[1]。作为非损伤性刺激之一，对人类生活中“不可控”的挫折等状态，束缚应激可进行较好的模拟，故而可作为良好的心理应激模型[2]。在日常生活中人们不仅会受到急性刺激，还有许多慢性不可预知性的刺激，这都是影响人类健康的不可抗拒的因素。而目前研究多只采用其中的一种来研究对实验目标的影响和机制，因此本项目将两种应激模型结合起来[3]，研究更具有现实意义。本文将探讨这两种应激同时作用时其损伤小鼠卵母细胞的发育能力的机制，从而为研究改善女性生殖健康提供一定的铺垫。

2.材料与方法

2.1实验动物 6-8周清洁级小鼠，济南朋悦实验动物繁育有限公司。

2.2主要试剂 卵母细胞成熟培养液、磷酸盐缓冲液（PBS）、M2操作液、CZB液

2.3实验方法

2.3.1实验动物分组及模型建立

雌性KM小鼠20只，遵循随机原则，在适应性饲养结束后，划分为为CUMS组）、WRS组、CACS组、对照组等4组，每组5只。小鼠置于12小时昼夜交替恒温条件下饲养。对照组小鼠正常饲养 28 天；CUMS组每日随机使用一种或多种温和应激方法，注意要避免因接连出现同种应激方法而使小鼠适应的情况发生，共持续4周。以下七项为一周期①禁食12h②禁水12h③夹尾1min④强迫4℃浸水5min⑤24h明暗颠倒⑥潮湿垫料12h⑦饲养笼倾斜30~45度12h。WRS组前三周小鼠正常饲养，之后将小鼠置于适宜大小的细铁丝笼子，保证小鼠能稍微活动却不能掉头转身。小鼠可以正常饮水和采食，光照与温度也和对照组高度一致。束缚应激处理每日在相同时间内持续6h,连续7天。CACS组小鼠前三周刺激同CUMS组，刺激结束1天后立即给予束缚应激同WRS组。

2.4观察指标

2.4.1获取卵母细胞数

小鼠麻醉后，开腹腔，取出小鼠双侧卵巢，将卵巢周围组织去除干净以备用。使用刺卵针作为工具，在实体显微镜的帮助下，对卵巢表面有腔卵泡进行挑破处理，进而采集卵丘卵母细胞复合体（），并对卵母细胞数进行统计。

2.4.2卵母细胞体外成熟率和体内排卵数

使用M2操作液清洗3遍，后以成熟培养液冲洗，再在、湿度、、空气的培养箱环境中，以成熟培养液培养左右（培养滴为μl，培养卵母细胞数为个/滴）。【成熟培养液：基础培养液为，添加()胎牛血清, 0.05 IU/ml FSH, 0.05 IU/ml LH, 1μg/ml 17β-雌二醇、24.2 mg/L丙酮酸钠、10ng/ml EGF、100IU/ml青霉素和100μg/ml 硫酸链霉素。】培养结束后，在显微镜下吸出卵母细胞，先于 PBS中 洗两遍，再用透明质酸酶滴来脱去颗粒细胞，观察卵母细胞是否排出第一极体，并计数。

2.4.3小鼠囊胚形成率和囊胚细胞数

在不含的无糖中，培养原核胚，具体有以下培养条件： 、湿度、。待达3-4细胞，换用含葡萄糖的，继续对胚胎进行培养，直至发育为囊胚。激活或受精后，在

、96h两时刻，分别对胚胎的发育进行观察并记录；对囊胚细胞数，在96h进行染色检查，并统计囊胚形成率。

2.5统计分析  

采用，作图采用Graph；计量资料表示为（）。对数据为两组的，进行独立样本t检验；对数据为三组及以上的，进行单因素方差分析；在多重比较方面，采用法。单因素方差分析不适用的，采取秩和检验的方式进行比较。P＜0.05为存在统计学差异。

3 结果

3.1 小鼠束缚应激模型笼具的制作

图1. 小鼠束缚应激试验装置（A.自制的笼具；B. 模式图；C-D.束缚状态下的小鼠）

小鼠束缚装置为本实验室自制的，材质为铁丝，笼内放置颗粒饲料并外接有水瓶，这样小鼠在束缚的状态下可以自由饮食。

3.2 卵母细胞回收率

图2. 各组小鼠超排后卵母细胞获卵数的检测

如图2所示，超排后获卵数对照组为30余枚，而模型组仅为20余枚。结果表明，与对照组相比，模型组超排后卵母细胞获卵数显著降低（P＜0.05）。

3.3 小鼠卵母细胞体外成熟率和体内排卵数

图3. 各组小鼠卵母细胞体外成熟率和体内排卵数的检测

图3所示，对照组的小鼠卵母细胞体外成熟率显著高于模型组（P＜0.05），对照组的体内排卵数也明显比模型组高。（P＜0.01）。

3.4 小鼠囊胚形成率和囊胚细胞数

图4.各组小鼠的囊胚形成率和囊胚细胞数的检测

图4所示，对照组小鼠的囊胚形成率显著比模型组高（P＜0.01），对照组小鼠的囊胚细胞数比模型组高（P＜0.01）。

4.讨论

由于应激的发生无形且隐蔽，大多数人意识不到自己正处在应激之中，但当其积累到一定程度就会致病，导致内分泌失调甚至是抑郁症。抑郁症对人类的生理和心理健康都会产生巨大的危害，且不易被觉察到，抑郁症病人多具有自杀倾向，严重威胁生命健康。在本实验中，结果显示模型组超排后卵母细胞获卵数显著低于对照组，表明束缚应激结合慢性不可预知性温和应激（CUMS）对小鼠卵母细胞的产生具有一定的影响。研究显示，对 （下丘脑-垂体-肾上腺）轴，束缚应激存在着激发作用，能够诱导促肾上腺皮质激素释放激素（）更多释放到血清和卵巢中，进而诱导壁颗粒细胞凋亡，具体机制不明[4]，可能存在多种通路的影响。模型组小鼠卵母细胞体外成熟率和囊胚形成率都低于对照组，推测束缚应激和结合慢性不可预知性温和应激（CUMS）对小鼠卵母细胞的发育能力有一定的损害，对卵母细胞的发育潜能也有一定的妨碍作用。已有研究表明，小鼠卵母细胞发育能力之所以降低，是束缚应激经血清FSH施加间接作用的结果，且在束缚应激的影响下，糖皮质激素分泌过量也会使得卵母细胞的发育能力受到直接损伤[1]。本实验中，所用小鼠数量较少，有待于进一步改进；另外，本文并未深入到基因水平去进一步挖掘具体分子作用机制和信号通路，仍有待进一步深究。总之，本文将两种应激结合起来研究，揭示了束缚应激结合慢性不可预知性温和应激（CUMS）对小鼠卵母细胞的产生和发育带来的影响，为女性不孕和异常胚胎发育的研究提供了一定的线索，为提高后代的质量做出了一定的贡献，具有深刻的现实意义。

参考文献

[1]张思雨.束缚应激对小鼠卵母细胞发育能力的影响及机理研究[D].山东农业大学,2009.

[2]翟亚南,陈柏安,郭萌,等.束缚应激的研究进展[J].实验动物科学,2013,30(04):56-58+61.

[3]吕红,钱家鸣,金光亮,等.肠易激综合征慢急性联合应激动物模型的建立及其感觉、动力和心理行为的评价[J].中华内科杂志,2009(12):1035-1039.

[4]赵新跃. 束缚应激与CRH升高通过激活TNF-α系统损伤小鼠卵母细胞的发育能力[D].山东农业大学,2020.