细胞培养肉产业技术发展态势及建议

细胞培养肉产业技术发展态势及建议

丁利平,陈博文,陈庆领

浙江普康生物技术股份有限公司，浙江省杭州市310000

摘要：现如今，随着全球人口的增长，蛋白质供需矛盾逐渐凸显，传统畜牧业作为目前主要的动物蛋白供应方式，在满足市场消费的同时，也带来了温室气体排放、资源过度消耗、环境污染、人畜共患病流行、动物福利等一系列全球性的问题。鉴于传统畜牧业目前的弊端，细胞培养肉作为一种更加清洁、可持续、公正和健康的新型肉类生产方式被越来越多地关注。本文综述组织工程技术在细胞培养肉领域的应用进展。

关键词：细胞培养肉；产业技术；发展态势；建议

引言

肉类含有高质量的蛋白质、脂质、矿物质等各类营养素，是人类最重要食品之一。随着全球人口的持续增长和发展中国家收入水平的持续增加，全球肉类消费持续增长，我国的肉类消费增长尤为迅速。然而，传统的肉类生产需要消耗大量的自然资源，另外，还存在温室气体排放、动物福利、抗生素滥用等诸多问题。我国的人均资源占有量远低于世界平均水平，如何高效、绿色的生产肉类，践行大食物观，助力实现“双碳”目标实现，已经成为肉类生产最重要的议题。

1细胞培养肉的研究现状

目前以细胞培养为基础的动物组织工程研究在生物学和医学方面得到了广泛应用，而细胞培养技术在规模化培养肉生产中的应用却鲜见报道，组织工程的研究为细胞培养肉大规模生产奠定基础，提供了可行性方案。在20世纪50年代白鼠的成纤细胞以及白鼠的肾脏细胞已经成功应用到医学的毒理学研究。直到2002年，科学家BENJAMINSON及其团队从金鱼细胞中培养出了可食用的肌肉蛋白，细胞培养肉才得以开展研究。近年来美国和荷兰投入了大量资源开展相关研究，已经取得了突破性进展。美国南卡罗来纳医科大学的研究人员从火鸡中提取肌细胞，并将细胞培养于牛血清营养液中，得到了条型的火鸡肉，但由于缺乏脂肪及血液供应，培育出的火鸡肉口感较差。荷兰马斯特里赫特大学的POST教授利用成肌干细胞培养实现了人造牛肉汉堡在实验室层面上的生产。2019年3月，日本著名的食品企业日清食品控股公司宣布与东京大学合作，通过人工培育牛肌肉细胞成功制成约1cm3的肌肉组织。南京农业大学周光宏教授团队使用猪肌肉干细胞培养20d后，获得了中国第1块质量为5g的细胞培养肉。关于细胞培养肉的专利目前国内相对较少，主要细胞来源有禽类、鱼类、家畜类以及小鼠和人类的肌细胞。总体来说，关于细胞培养肉相关研究的报道还较少，且集中在细胞培养与诱导分化上。目前的细胞培养主要是针对疾病治疗的医学研究以及动物育种，仅能在实验室进行少量的培养。

3细胞培养肉产业技术发展态势及建议

3.1种子细胞库建立

获取适用于制备细胞培养肉的种子细胞并建立细胞库，是细胞培养肉工业化生产的首要任务。建立种子细胞库的主要流程有种子细胞的分离纯化、细胞鉴定、微生物与病原体检测，随后将符合标准的种子细胞分类冻存并标记。在种子细胞的分离纯化环节，不同类型种子细胞的提取或者细胞系构建方法存在差异性。对于胚胎干细胞，一般使用囊胚内细胞团培养法进行分离和建系。在成纤维细胞等体细胞中过表达关键转录因子（OSKM因子）可建立诱导多能干细胞系，也可以利用小分子化学刺激、mRNA技术实现重编程诱导。肌肉干细胞、间充质干细胞等成体干细胞主要从组织中分离获取，通用方法有组织块贴壁法、酶消化法等，进一步采用密度梯度离心法、差速贴壁法、流式分选法、免疫磁珠分选法等进行细胞纯化。我国研究团队在肌肉干细胞的分离、纯化等方向已开展系统研究，比较了多种蛋白酶（如链霉蛋白酶、分散酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶）对肌肉组织的消化效力，建立了适用于细胞培养肉工业化生产的细胞分离纯化方法。在初步获得较纯的种子细胞后，需对种子细胞进行鉴定，可选方法有：利用聚合酶链式反应（PCR）检测法鉴定种属、通过细胞形态观察、免疫特异性检测确定细胞类型、采用标记染色体检测遗传标志、通过细胞培养验证细胞活力及均一性。由于原始种子细胞来源于动物个体，极易受到外部环境污染，也需进行微生物和病原体检测，可采用接种观察法、镜检法，基因探针、PCR技术等分子诊断方法进行检测。待种子细胞检定合格后，需标记并放置于液氮或-130℃以下环境中以便稳定储存。种子细胞库的稳定运行及良好维护，将为细胞培养肉的大规模生产提供检定合格、质量一致、持续稳定的细胞资源。

3.2无血清培养基

培养基是细胞培养肉生产的“饲料”，主要给种子细胞的增殖、分化等过程提供合适的营养，并维持特定的细胞命运过程。传统的血清主要来源于动物，存在批次间不稳定，易于受供体病毒污染等问题。研制无血清培养基，甚至是化学成分明确的培养基，有助于培养基的标准化生产。通过对相关成分成本进行优化，还能够实现培养基的低成本生产。近年来，随着相关研究的深入，细胞培养肉领域在无血清甚至化学成分明确的培养基研究上有了巨大的发展。研究人员通过早期基于转录组学和蛋白组学，利用增殖分化的关键因子，建立了猪肌肉干细胞增殖分化无血清培养基配方。还有研究者利用转录组学，根据特定的受体蛋白变化以及关键的通路变化，研制了增殖以及分化的化学成分明确的培养基。基于早期的胚胎干细胞E8的研究成果以及高稳定性的FGF-G3生长因子，研究人员研制了B8培养基，适用于牛肌肉干细胞增殖的无血清增殖培养基。另外，在生长因子的表达上，随着代谢工程和合成生物学的发展，对生长因子的改造使其稳定性有了极大提高，从而减少了生长因子的使用量，提高了生长因子的使用效率，并降低了培养基的整体成本。得益于组学技术（转录组、蛋白组和代谢组）的快速发展，以及高内涵显微镜设备的快速发展及应用，培养基的优化速度有了快速的提升。由于培养基中多达数十种甚至上百种物质，相关物质及其使用浓度的互相影响也很难直接通过试验阐述清楚。而通过高通量的成像设备提供的数据基础，利用人工智能进行机器学习和预测，再利用高通量设备对人工智能推荐的配方组合进行验证，可以达到优化培养基配方的目的。国内外已有大量的培养基公司在进行大规模培养基生产，这为培养肉后期的培养基产业化奠定坚实的基础。

3.3种子细胞悬浮培养

作者前期的研究发现，幼年小猪1g肌肉组织中约含有104个肌肉干细胞，而生产1kg培养肉所需要的细胞数为1010～1011个，因此，单个细胞至少需要增殖106个才能实现1g肉生产1kg细胞培养肉。二维培养方式存在表面积体积比低，人力使用量大，易污染等诸多问题。要想实现有效率的扩增，甚至是未来更大规模的培养，则必须实现细胞的悬浮培养。悬浮培养的方式主要包括微载体悬浮培养、固定化培养，聚集体悬浮培养以及单细胞悬浮培养等方法。肌肉干细胞由于最早的贴壁培养特性，目前已经有多种方式实现了肌肉干细胞的微载体培养，包括使用cytodex系列微载体以及3D多孔胶原微载体。同样的培养方式在间充质干细胞的放大培养中也有应用。然而，微载体上承载的细胞数相对有限，单次微载体的扩增的细胞数目极限约为105-106个每毫升，细胞在微载体上的单次扩增倍数仅为10～20倍，消化放大困难，操作也较为复杂，不利于更大规模的细胞培养。另一种更为高效的培养方式为细胞无载体悬浮培养，其操作简单，放大方便，成本低，然而，需要前期对细胞进行驯化。胚胎干细胞由于自身的克隆生长特性，因此可以实现聚集体的无载体悬浮培养，然而，该种方式不利于对细胞密度敏感的纤维类细胞。单细胞悬浮或者少量聚集体的悬浮培养方式更值得借鉴。中国仓鼠卵巢细胞是一株成纤维细胞，最早是贴壁培养方式并逐渐驯化成悬浮培养方式，从而广泛地应用于生物制药行业，其驯化培养过程值得借鉴。在培养肉领域已有企业利用鸡的成纤维细胞系，实现了无载体的悬浮培养。也有企业利用从鸡的肌肉组织中分离的成纤维细胞，通过驯化形成了自己的可无载体悬浮培养的细胞系。作者团队也利用自研的化学成分明确的培养基，对纯化的猪肌肉干细胞进行驯化培养，从而实现了细胞的无载体培养从0到1的突破。未来，通过进一步筛选单克隆，优化培养基组成，来提高种子细胞悬浮培养的效率，从而降低培养肉的生产成本。

3.4培养环境优化

细胞培养肉要实现商业化生产，细胞的培养基原料和环境需要满足食品级，且成本低廉，并可以调节大规模细胞的增殖和分化。一般基础培养基中都含有碳源和氮源，是细胞的能量来源和结构形成基础。碳水化合物、氨基酸和脂类是肌肉组织细胞代谢的基本碳源类别，但通常这些物质的代谢效率明显低于葡萄糖，而且似乎对细胞生长不是最优。谷氨酰胺作为氮源可以代谢成许多其他氨基酸用于蛋白质组装，水解也可以再生还原型辅酶Ⅱ(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)。NADPH是细胞许多合成代谢途径中所必需的还原剂，其再生进一步强调了谷氨酰胺在细胞培养环境中的重要性。因此基础培养基中需要添加游离葡萄糖、谷氨酰胺和某些其他氨基酸用于肌肉细胞增殖(O'Neilletal.,2021)。传统干细胞培养通常是在含有一些营养素和动物血清的培养基中，以提供细胞增殖所需的营养因子及促进细胞贴壁，同时传统培养基中还添加有抗生素以减少细菌污染，但抗生素的添加可能会导致耐抗生素细菌的增加和消费者接受度下降(O'Neilletal.,2021)。而动物血清成分尚未明确、品质难以控制，因此工业化生产中要求使用化学定义的培养基。化学定义的培养基要求必须识别所有成分，并具有已知的准确浓度，不含胎牛血清、牛血清白蛋白和人血清白蛋白(Pandurangan,Kim,2015)。因此，开发无血清培养体系对工业化生产细胞培养肉有重要影响。无血清培养体系包括无血清培养基的开发、细胞株的适应驯化以及细胞规模化培养等关键技术(张国强等,2019)。VanderValk等(2010)总结了无血清培养基开发的“培养金字塔”示意性模块化方法，其中金字塔底部为基础培养基，从下到上需要添加特定激素、生长因子、维生素和抗氧化剂等，金字塔越靠近顶端表示培养基特异性越大。他还提出了几种方法可以使培养细胞适应无血清培养基。

结语

组织工程技术在再生医学领域被广泛研究和应用，已有多种源于组织工程技术的医疗器械产品进入成熟的批量生产阶段并造福于人类健康。由于细胞培养肉的食品属性与医疗器械产品的医用属性之间的固有差异，利用组织工程技术实现细胞培养肉的规模化量产还面临着诸多挑战，然而，随着国家有关部门对细胞培养肉监管政策法规的出台以及未来的市场消费需求，势必会成为推动组织工程技术在细胞培养肉领域广泛研究并应用的重要推动力。

参考文献

[1]关欣,周景文,堵国成,等.培育肉生产技术发展研究[J].中国工程科学,2021,23(6):178‒186.

[2]古希波,张英.生物安全柜的选择、安装与使用[J].医疗卫生装备,2020,31(7):94‒96.

[3]阿尔祖古丽·阿依丁,阿依木古丽,乔自林,等.动物细胞生物反应器大规模培养技术研究进展[J].甘肃畜牧兽医,2020,48(11):11‒13.