血管周围干细胞作为软骨组织工程种子细胞可能的体外实验研究

血管周围干细胞作为软骨组织工程种子细胞可能的体外实验研究

张金鑫   ,张立

（大理大学第三附属医院，云南 大理白族自治州671000）

摘要

目的:探讨经体外扩增、诱导分化的人血管周围干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。 方法:利用流式分选技术获得大鼠皮下组织的血管周围干细胞，体外分离、 培养、 扩增。 诱导 血管周围干细胞向软骨细胞分化。在体外环境下观察血管周围干细胞向三系诱导情况。以脂肪干细胞为对照组，用实时定量PCR方法观察血管周围干细胞向成软骨诱导后SOX9、II型胶原的mRNA的表达水平。采用western-blot方法观察血管周围干细胞向成软骨诱导后SOX9、II型胶原的蛋白表达水平。结果:通过流式分选技术得到血管周围干细胞（CD146+CD34+CD45-CD31-）, 在体外扩增, 其形态及表面抗原保持不变。可以成骨、成软骨、成脂肪诱导（三系诱导），血管周围干细胞向成软骨诱导后SOX9、II型胶原的mRNA的表达水平大于对照组( P <0.05)，成软骨诱导后SOX9、II型胶原的蛋白表达水平大于对照组( P <0.05)。结论:血管外周细胞在体外可大量扩增。在特定培养液诱导下, 可向成软骨细胞转化, 可作为软骨组织工程的较理想的种子细胞。

关键词:血管周围干细胞;成软骨细胞;软骨细胞;软骨组织工程

膝关节软骨组织的缺损, 传统方法是以自体、 异体组织作为供体进行修复, 但其存在着供体来源有限 、供体与受体形状匹配困难 、异物反应及易感染等不足。而以生物学及工程学的方法, 合成具有功能的损伤组织替代物的组织工程技术有望解决上述难题 。种子细胞及其来源问题是目前组织工程在生物学方面面临的最大难题[ 1] 。血管周围干细胞在一定的条件下可向成骨细胞、 软骨细胞、 脂肪细胞、 肌腱及韧带等分化 [ 2] , 为组织工程种子细胞的来源开辟了新的途径。我们以血管周围干细胞为研究对象, 将其分离 、 体外扩增并建立了诱导其向成软骨细胞的培养体系 ;探讨了其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性,为进行下一步的软骨工程软骨的构建研究奠定了基础 。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠15只，3周龄，雄性（由解放军总医院动物中心提供）；II 型胶原酶为美国Sigma 公司产品；DMEM、PBS 液、培养皿、50 ml离心管、25 cm2 培养瓶、75 cm2 培养瓶、胰蛋白酶均为美国 Corning 公司产品；胎牛血清为北京元亨圣马生物技术公司产品；双抗购自碧云天生物技术有限公司；CD146-APC 荧光标记流式抗体购自美国 R&D 公司；CD34-PE-Cy7 荧光标记流式抗体购自美国 Santa Cruz 公司；CD45-PE 荧光标记流式抗体、CD90-PE 荧光标记流式抗体、血细胞裂解液购自美国 BD 公司；CD29-PE 荧光标记流式抗体、CD44H-PE 荧光标记流式抗体购自美国eBioscience 公司。脂肪干细胞成软骨诱导剂（赛业生物科技有限公司）。

1 .2 方法

1 .2 .1 利用II型胶原酶消化SD大鼠皮下脂肪组织获取SVF(血管外基质成分), 以1 073 g/L 的 Percoll 采用密度梯度离心法分离 。将收获的细胞以含 100 mL/L FBS 的 DMEM 置 37 ℃、50 mL/LCO2 培养箱中培养。培养的第 5 天首次换液, 以后每 wk 换液 2 次。待细胞长至 90 %融合时, 用2 .5 g/L 胰蛋白酶 1 mmol/L EDTA 消化, 按1∶3 传 代, 以选定的培养基、 血清及其适宜浓度进行扩增培养。

1 .2 .2通过流式细胞技术标记特异性表面分子(CD146+CD34+CD45-CD31-)分选出血管周围干细胞。将过滤后得到SVF离心后，弃废液，加入红细胞裂解液，室温静置10min后，1700r离心5min，弃废液，加入培养液20ml（DMEM+10%胎牛血清+1%双抗），混匀后分装至5支流式管中，加入抗-大鼠CD34流式抗体、抗-大鼠CD45流式抗体、抗-大鼠CD146流式抗体、抗-大鼠CD31流式抗体，室温避光孵育15min，上机分选（BD FACS Ara），分选出血管周围干细胞（CD45-CD31-CD34+CD146+）（图1），接种至25cm2培养瓶中，37℃ 5%CO2培养箱中，2-3天换液，待细胞融合达70%-80%后传代，传至P4代使用。

1 .2 .3 血管周围干细胞向成软骨细胞的体外诱导分化将 血管周围干细胞接种于 6 孔板中, 各孔加入 2 mL DMEM 完全培养液, 次日换为无血清诱导培养液( 脂肪干细胞成软骨诱导剂（赛业生物科技有限公司）) 。对照孔内只加入 2 mL 完全 DMEM 。对诱导后的细胞行甲苯胺蓝染色, 电镜观察 。用免疫组化染色及 RT-PCR, 检测COL-Ⅱ、SOX9蛋白及其 mRNA 的表达 。扩增 COL Ⅱ、SOX9基因的引 物 序列 :Col2a1(上游5、-TCACACCTTCCCATTGTTGA-3、，下游5、-TCAGGTCAGCCATTCAGTGC-3、);SOX9(上游5、-GTTTGACCAATACCTGCCGC-3、，下游5、-GCCTGTTGCTTTGACATCCA-3、)。PCR 扩增条件同上。 PCR 产物的大小为352 bp

1 .2 .4Western blot 检测蛋白表达 转染后 72 h分别收集各组细胞，提取蛋白。Western blot 检测SOX9、CollagenⅡ和 Aggrecan 的蛋白表达。

1 .2 .5阿利新蓝染色 将转染 72 h 的各组细胞分别用 40 g／L 多聚甲醛固定 30 min，根据阿利新蓝染色试剂盒说明书将细胞染色，软骨细胞中的酸性黏蛋白和蛋白多糖会被染成蓝色，用于检测软骨细胞的细胞外基质合成情况。

2 结果

2.1 通过流式细胞技术标记特异性表面分子(CD146+CD34+CD45-CD31-)分选出血管周围干细胞（图1）。

2.2诱导后COL Ⅱ、SOX9 mRNA 表达的 RT-PCR 分析  血管周围干细胞成软骨诱导后，均可见COL Ⅱ、SOX9表达，且表达水平大于对照组( P <0.05)。（图2）

2.3 诱导后COL Ⅱ、SOX9蛋白表达的 western-blot分析 成软骨诱导后SOX9、II型胶原的蛋白表达水平大于对照组( P <0.05)。（图3）

2.4 阿利新蓝染色 将经成软骨诱导培养的血管周围干细胞爬片染色后, 可见细胞周围有大量的甲苯胺蓝异染性基质 （图4）。

3讨论

目前，在软骨组织工程中广泛应用的种子细胞分为骨髓来源的间充质干细胞 BMSCs、脂肪来源的间充质干细胞 ADSCs、滑膜来源的间充质干细胞 SMSCs 以及自体软骨细胞。虽然这些种子细胞在软骨的组织工程修复中都发挥了良好的功能[3-5]，甚至有些已经应用到了临床治疗中，然而实际应用中软骨细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜干细胞依然存在着来源不足、获取过程要进行有创操作、体外培养难以快速获得修复缺损所需的大量细胞及长时间培养中细胞的去分化和老化等问题。即使脂肪来源的间充质干细胞具有来源充足、取材方便、对人体造成的创伤较小且容易获得大量细胞等优势，但是所获的细胞为多种细胞的集合体，不纯的细胞对骨和软骨的修复效果影响很大[6]，且细胞体外培养传代的过程中明显影响干细胞的基因变化，从而影响增殖分化等功能。血管周围干细胞被认为是一种纯净的间充质干细胞，其经过流式细胞仪分选后可不经过体外培养直接进行自体细胞移植，极大地保留了干细胞原有的功能和性质，克服了之前已有的种子细胞所存在的种种问题，且已经被美国食品药品管理局认证为安全有效可以应用于临床治疗[7]。在特定条件下，是否能分化成软骨细胞，成为血管周围干细胞作为软骨组织工程种子细胞并临床应用的关键。

综上，本实验通过流式分选的血管外周细胞在体外可大量扩增。在特定培养液诱导下, 可向成软骨细胞转化, 为其在软骨组织工程中作为 种子细胞的临床应用奠定了基础。

（图1）

（图2）

（图3）

（图4）

参考文献

1. Griffith LG, Naughton G .Tissue engineering-current challenges and expanding opportunities[ J] .Science, 2002, 295( 5557) :1009-1014.
2. 王 琪, 方向东, 戚正武.干细胞的研究进展[ J] .细胞与分子免疫学杂志, 2001, 17( 1) :91-94.
3. Via AG, Frizziero A, Oliva F. Biological properties of mesenchymal stem cells from different sources. Muscles Ligaments Tendons J, 2012, 2(3):154-162.
4. Wang SP. The research progress on cell sources of cartilage tissue engineering. Chin J Aesthetic Med, 2012, 21(11):1655-1658.
5. Hui JH, Li L, Teo YH, et al. Comparative study of the ability of mesenchymal stem cells derived from bone marrow, periosteum, and adipose tissue in treatment of partial growth arrest in rabbit. Tissue Eng, 2005, 11(5-6):904-912.
6. James A.W, Zara JN, Corselli M, et al. An abundant perivascular source of stem cells for bone tissue engineering. Stem Cells TranslMed, 2012, 1(9):673-684.
7. Zhao WJ, Xing GS, Yu SL. Application of synovium-derived mesenchymal stem cells in tissue engineering. Chin J Reparative Reconstr Surg, 2011, 25(12):1504-1507.

[基金项目]云南省教育厅科学研究基金项目（2021J0368）

作者简介；张金鑫，硕士，主治医师