生物酶法制备头孢拉定的工艺研究

生物酶法制备头孢拉定的工艺研究

孙晴12,王京12，祁浩杰12,闫志斌12,吴少华12，侯鹏飞12,武亚锋12，刘兴12，陈平12

1天俱时工程科技集团有限公司，河北石家庄市050000；2.河北制药用酶集成应用技术创新中心，河北石家庄市050000

摘要：头孢拉定作为基础用药，市场需求巨大，针对化学合成的各种弊端，采用生物酶催化法制备头孢拉定。通过通过单因素实验，系统考察各因素对合成反应的反应时间、收率和产品纯度的影响。最终确定合成反应母核侧链投料比为1:1.3，母核与酶投料比为1:4，反应温度为20~25℃，最终合成反应收率达到135%，产品纯度为98%以上。本研究为固定化酶反应的工业化生产提供了实验依据，为企业进一步降低成本、提高效益提供了参考与借鉴，具有实际应用价值。

关键词：酶法；制备；头孢拉定；青霉素酰化酶

中图分类号：Q814       文献标志码：A

第一作者：孙晴(1983年—)，女，本科，工程师。研究方向：工业废水处理技术。weinimu@163.com。

[基金项目]河北省创新能力提升计划项目（NO.22567671H）

中图分类号Q814 文献标识码A

头孢拉定属于第一代半合成头孢菌素，对耐药性金葡菌及其它多种对广谱抗生素耐药的杆菌有迅速而可靠的杀菌作用，在临床上具有广泛的应用价值，是国民需求量较大的基础用药[1-2]。

生产头孢拉定的方法主要有化学法和生物酶法。目前广泛应用的化学法是将母核7-ADCA和侧链双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐预保护后进行缩合反应，再经过水解、结晶，得到头孢拉定产品。合成反应需要处于无水和低温的环境中，设备条件要求严苛，反应周期长[3]。生产过程中需要使用大量有机溶剂和试剂，一方面会造成溶剂残留影响产品质量，另一方面生产废水较多，后期处理难度大，费用高。

由于化学法的诸多缺点，近年来诸多企业开始利用生物酶法合成头孢拉定。此法是利用固定化的青霉素酰化酶将母核7-ADCA和侧链双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐在常温下进行缩合反应，一步催化即可得到目标产物[4]。作为催化剂的固定化酶可以回收利用进而节约成本[5]。该工艺条件温和，反应转化率高，副产物少，而且不使用有机溶剂，对环境友好，与化学法相比酶法更加有利于工业化生产[6]。

本研究以7-ADCA和双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐为反应底物，在固定酶的催化下，缩合反应生成头孢拉定。通过单因素影响实验，确定最适宜的反应条件，优化合成工艺路线，为工业生产作支撑。

1仪器和材料

仪器：酸碱自动滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；低温恒温反应浴，巩义市英峪高科仪器厂；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司等；四口反应器；高效液相色谱，岛津。

试剂：7-ADCA，华北制药股份有限公司；双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐，华北制药股份有限公司；固定化青霉素酰化酶，华北制药股份有限公司；盐酸，石家庄市化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；氢氧化钠，天茂化工有限公司；青霉素G，河南华星药厂；无水乙醇，天茂化工有限公司；新戊二醇二缩水甘油醚，上海麦克林生化科技有限公司。

2方法

1.1合成方法

用分析天平精确称取7-ADCA和双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐到四口瓶中，加纯化水开启搅拌，待原料溶解后，控制温度至实验要求，调节pH至7.2后加入固定化青霉素酰化酶开始反应，每30 min取样一次用高效液相色谱检测四口瓶中原料和产物的含量，反应结束后将产品和酶分离，清洗酶后回收。

1.2单因素实验

投料比：将7-ADCA（母核）与双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐（侧链）投料比设置为1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4，其他条件不变，进行酶法合成。

温度：将投料比实验中得到的最优母核侧链比作为实验条件，温度分别设置为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，其他条件不变进行酶法合成。

投酶量：将投料比和温度实验中得到的最优母核侧链比和温度作为实验条件，母核与酶的投料比设置为1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5，其他条件不变进行酶法合成。

1.3分析方法

1.3.1酶活测定

精密称取青霉素G钾盐1.0 g至四口烧瓶中，加入50 ml K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，调节水浴温度为32 ℃，开启搅拌，设置自动滴定仪pH值为7.5，加入固定化酶1.0 g后开启自动滴定。反应时间6 min，记录消耗的NaOH溶液的体积。

固定化酶的酶活计算公式为：

在上述公式中：CNaOH表示NaOH溶液的浓度，mol/L；VNaOH表示消耗的NaOH溶液体积，L；W固酶表示固定化酶的重量，g。

酶活性定义：单位质量(g)的固定化酶，在1 min内每水解1 μmol青霉素G为1个单位(U)。在这里以每分钟消耗1 mol NaOH来计量。

1.3.2液相测定

色谱柱Hypersil ODSZ-C 18柱(4.6 mmX250 mm,5 μm)。流动相为甲醇:磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.0)=30:70(V/V)。检测条件为流速：0.8 ml/min；波长：214 nm；进样量:10 μl；柱温:40 ℃。

3 结果与分析

3.1母核与侧链投料比对反应的影响

表1  母核与侧链的投料比对反应的影响

由表1结果可知，侧链的加入量明显影响合成收率和产品纯度，增加侧链的加入量，可以缩短反应时间，提高产品收率。但是过高的侧链量，会使过量的侧链在酶的作用下水解生成双氢苯甘氨酸，降低产品纯度。所以母核侧链投料比确定为1:1.3。

3.2温度对反应的影响

表2  温度对反应的影响

由表2结果可知，温度对反应时间、收率和产品纯度都有较大的影响。在15℃的低温时有助于反应的完全进行，产品收率较高，但是反应时间相应较长，造成能耗增大。在一定的温度范围内，随着温度的升高，反应时间相应缩短，温度到达30 ℃时，反应速率再次减缓，反应的收率减小，这可能是因为反应的温度过高会使酶蛋白失活变性，致使合成反应减缓，影响收率和产品纯度。所以反应温度确定为20~25 ℃。

3.3投酶量对反应的影响

表3  投酶量对反应的影响

由表3结果可知，当母核与酶的投料比为1:2时，反应时间长，副产物较多，随着酶量的增加，合成速度开始加快，到终点的反应时间缩短，纯度提高。当母核与酶的投料比继续增大到1:5时，反应收率和产品纯度均开始下降，究其原因可能是因为过多的酶占用反应器的有效体积，不易搅拌均匀，造成反应无法完全进行。所以母核与酶投料比确定为1:4。

4结论

生物酶法制备头孢拉定，工艺条件温和，反应的转化率高，副产物少，而且不使用有机溶剂，对环境友好，有利于工业化生产。本研究用固定化青霉素酰化酶催化7-ADCA 和双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐合成头孢拉定。通过单因素实验法，系统考察各因素对合成反应的反应时间、收率和产品纯度的影响，分析最优实验条件，最终确定以下工艺路线：将7-ADCA（母核）与双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐（侧链）按照1:1.3精确称量至四口瓶中，加纯化水至刻度后开启搅拌，温度控制在20~25 ℃之间，待原料溶解后调节pH至7.2，按照母核与酶投料比为1:4的量加入固定化青霉素酰化酶开始反应，每30 min取样一次，用高效液相色谱检测四口瓶中原料和产物的含量，当pH开始下降时即到反应终点，反应时长约6.2 h。分离产品与酶，将酶清洗回收，对产品进行重结晶。将产品称重，计算收率，用高效液相色谱分析纯度。

参考文献

[1] 蒋翠媛. 头孢拉定的生物酶催化法制备及结晶过程研究[D]. 石家庄 河北科技大学, 2018.

[2] 金蕾,杨耀芳. 头孢菌素类抗生素在不同级别医院应用情况分析[J]. 国外医药(抗生素分册), 2014, 35(3): 123-127.

[3] 李文杰,曹桂僖. 头孢拉定合成工艺的优化[J]. 国外医药(抗生素分册), 2019, 40(1): 65-68.

[4] Zdarta J, Meyer A S, Jesionowski T, et al. Developments in Support Materials for Immobilization of Oxidoreductases: a Comprehensive Review.[J]. Advances in Colloid and Interface Science, 2018, 258: 1-20.

[5] 叶树祥,徐成苗,王佳兵. 固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究[J]. 中国医药工业杂志, 2007(9): 619-620.

[6] 范宜晓,王学恭,刘庆芬. 酶法技术在发酵类制药中的研究与应用[J]. 生物产业技术, 2019, 70(2): 38-48.