利用基因编辑技术创制玉米自交系新等位突变

利用基因编辑技术创制玉米自交系新等位突变

刘丹

北大荒垦丰种业股份有限公司  黑龙江哈尔滨  150010

摘要：转基因是将高产、抗逆、抗病虫、提高营养品质等已知功能性状的基因，通过现代科技手段转入到目标生物体中，使受体生物获得新的功能特性，产生新的品种和新的产品。转基因在医药、工业、农业、环保、能源领域得到广泛应用。

关键词：玉米；类受体激酶；ＺｍＲＬＫ７；基因编辑；等位突变

引言

20世纪初，丹麦科学家约翰根据孟德尔遗传定律，在《遗传学原理》一书中，正式提出“基因”概念。20世纪20年代，美国遗传学家摩尔根通过果蝇杂交试验，验证了孟德尔的遗传分离和自由组合定律，并将基因定位于染色体上，由此创立了基因连锁与互换的遗传学第三定律。1953年，沃森和克里克提出了DNA（脱氧核糖核酸）的双螺旋结构模型，使人们对遗传现象的认识从染色体水平深入到分子水平，标志着分子生物学的开端。

１材料与方法

1.1主要试验材料

本试验所用ＣＰＢ－ＺｍＵｂｉ－ｈｓｐＣａｓ９载体质粒由中国农业科学院谢传晓研究员课题组提供，全长１６８９３ｂｐ；ＤＨ５α大肠杆菌感受态细胞和ＥＨＡ１０５农杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；制备原生质体所用的玉米自交系种子由本单位提供并保存。

1.2仪器与设备

NanodropND-2000核酸定量仪、MiniAmp普通PCR仪、ABI7500实时荧光PCR仪均为美国ThermoFisherScientific公司生产；VX-200旋涡混匀仪为美国Labnet公司生产；5424R台式离心机为德国Eppendorf公司生产；H2O3-PRO金属浴购自北京卡尤迪公司。

1.3靶位点的设计

在maizeGDB数据库(https://www.maizeg-db.org/)中查阅并下载玉米ZmRLK7基因序列作为目标序列。通过CRISPR-P在线设计网站(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)分别设计ZmR-LK7基因的2个靶位点T1和T2。筛选符合以下标准的靶标:网站给出的分数在80或80以上、脱靶位点少、位于5'-UTR附近或者活性位点区域、外显子上的靶标。

1.4特异性验证

依照优化好的普通PCR和实时荧光PCR方法对选取的7种样品进行特异性验证，并设置空白对照。特异性验证样品包括：阴性对照；1%的转基因抗虫玉米CM8101；其他转基因玉米混合样品（3272、59122、Bt11、Bt176、GA21、NK603、T25、TC1507、MIR604、MON810、MON863、MON87460、MON88017、MON89034）；转基因水稻混合样品（M12、TT51、克螟稻、科丰6号、科丰8号）；转基因大豆混合样品（305423、356043、A2704-12、A5547-127、CV127、GTS40-3-2、MON89788）；转基因棉花混合样品（LLCOTTON25、MON1445、MON15985、MON531、MON88913）；转基因油菜混合样品（RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Oxy235、T45、Topas19/2）。转基因混合样品中的每种转化体含量均为1%。

２结果与分析

目前，农业转基因产业化应用最多最广的是转基因农作物。转基因农作物通过利用基因重组技术，将来源于其他生物或特定物种的目的基因转入作物细胞内，经过培育、筛选，得到具有特殊性状的农作物新品种[14]。转基因农作物可获得一些优良性状，如高产优质（增产效果明显）、抗病抗虫（可以减轻作物病虫害发生和减少化学农药使用）、耐除草剂（可以使用对应的除草剂除草并能降低除草成本）、抗逆性强（抗干旱、耐盐碱、抗低温）、耐储存（能够延长储存时间）、提高营养成分含量（增加蛋白质含量）、改善农产品品质（改善口感、色泽）等优良性状。全球已经大规模推广种植的转基因农作物，主要目标性状涉及抗虫、耐除草剂、抗菌、抗病毒、抗干旱等。同时，为了满足农产品生产、加工、消费的多样化、多用途需求，一批优良性状新基因被克隆和开发应用，包括抗虫性状（如抗马铃薯甲虫）、耐除草剂性状（如耐草丁膦）、抗病性状（如抗黄瓜花叶病）、抗逆性状（如耐盐碱）、耐储存（控制果实成熟）、品质改良性状（如富含伽马氨基丁酸番茄）。而且，在农业转基因研究中，经常同时转入多个外源基因，使农作物获得多个优良性状。

3讨论与结论

对玉米进行基因组编辑可望定向创造玉米突变体及新种质，所创制的突变体材料既能够作为基因功能研究的反向遗传材料，又能够直接作为遗传育种材料使用。利用基因编辑株系可以通过有性杂交将编辑的等位基因传递给不适宜转基因的玉米株系，如利用植株杂交技术将编辑位点导入玉米Ｂ７３自交系，诱发后者野生型等位基因发生预期突变，由此可以打破传统育种瓶颈。本研究利用原生质体转化，将带有ＺｍＲＬＫ７基因的两个靶位点的基因编辑载体导入原生质体并进行验证，收集转化后的原生质体提取ＤＮＡ并进行ＰＣＲ扩增及测序，结果显示在所设计靶位点的目标ＤＮＡ区段序列产生了删除或单个ＳＮＰ的插入，由此证明了这两个靶位点编辑的有效性，可为进一步获得稳定的基因编辑玉米株系奠定基础。

结束语

转基因技术克服了物种间的生殖隔离，通过DNA分子杂交方式将遗传基因转入细胞内，从而使其具备新的遗传基因并获得优良性状。因此，转基因技术在农业中具有巨大发展潜力和良好应用前景。2021年2月，农业农村部办公厅发布《关于鼓励农业转基因生物原始创新和规范生物材料转移转让转育的通知》，为农业生物育种提供了指导规范，对我国农业转基因生物研究和应用将起到促进作用。

参考文献

[1]农业部农业转基因生物安全管理办公室，中国科学技术协会科普部.农业转基因生物知识100问[M].北京：中国农业出版社，2020.

[2]旭日干，范云六，戴景瑞，等.转基因30年实践[M].北京：中国农业科学技术出版社，2020.

[3]段灿星，孙素丽，朱振东.全球转基因作物的发展状况[J].科技传播，2020，12(24)：29-31+48