新型微胶囊复合壁材糖基化蛋白的制备

新型微胶囊复合壁材糖基化蛋白的制备

朱军 詹伟华 于文博

杭州职业技术学院 310018

【摘要】微胶囊是一种具有具有负载运输、保护并控制释放其他活性物质特点的载体。微胶囊技术能够有效的保证活性物质的稳定性，同时能够防止各药物成分之间的接触反应，对于药物效果来讲，微胶囊能够通过确保药物在特定时间与位置进行缓释，以增强药物使用效果。微胶囊复合壁材一般为蛋白质与多糖，此类壁材包埋率有待提升，因此成本更加低廉的壁材原料成为当下微胶囊发展与研究的主要趋势。文章就糖基化蛋白新型微胶囊复合壁材的制备进行研究与分析，以对壁材的制备展开论述，以为新型微胶囊复合壁材提供全新材料。

【关键词】微胶囊 新型复合壁材 糖基化蛋白 壁材制备

【项目】本文系《新型微胶囊复合壁材糖基化蛋白的制备及其表征》杭州职业技术学院校级科研项目，项目编号：ky202208

微胶囊复合壁材包埋率、壁材成本、产业化应用可行性属于其应用考量的主要内容，但对于当下壁材原料来讲，部分壁材原料成本较高，且包埋率难以的提高，这也就影响着微胶囊的稳定性。美拉德反应能够对蛋白进行改性，以此能够制备出多糖和蛋白复合壁材，这也就有效的解决了多糖与蛋白单独应用的问题，对改善壁材综合性能，提升包埋率及其生物有效性具有重要意义。

一、糖基化蛋白制备方式

通过反应温度、时间、缓冲溶液的pH及质量比来探究糖基化蛋白复合壁材的最佳合成工艺，在最佳工艺条件下，采用干法、干湿法联用得出最佳的糖基化方式，然后以接枝度、红外光谱分析（FT-IR）、X射线衍射仪（XRD）、热重分析（TGA）、扫描电子显微镜（SEM）、平均粒径及PDI表征糖基化产物，通过表征来说明蛋白质结构发生变化，两者之间发生反应并生成复合物，并用于叶酸的包埋。

二、糖基化蛋白制备过程

2.1超声微波辅助制备糖基化产物

2.1.1反应温度对超声微波辅助制备糖基化产物的影响

称取一定量的酪蛋白/花生分离蛋白与壳寡糖（1:1 w/w）,溶解在一定量的磷酸盐缓冲溶液中（0.2 mol/L, pH=7.0），使得蛋白浓度为2 mg/mL。将混合溶液放置于磁力搅拌器上搅拌均匀，利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行合成。设置不同的温度（花生分离蛋白/酪蛋白：80℃、85℃、90℃、95℃、100℃），反应时间30 min，超声功率300 w，微波功率450 w。超声恒定模式进行超声微波合成。反应结束后，通过测定其接枝度来探讨反应温度对酪蛋白/花生分离蛋白糖基化改性的影响。

2.1.2反应时间对超声微波辅助制备糖基化产物的影响

称取一定量的酪蛋白/花生分离蛋白与壳寡糖（1:1 w/w）,溶解在一定量的磷酸盐缓冲溶液中（0.2 mol/L, pH=7.0），使得蛋白浓度为2 mg/mL。将混合溶液放置于磁力搅拌器上搅拌均匀，利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行合成。设置不同的时间（花生分离蛋白/酪蛋白：10 min、20 min、30 min、40 min、50 min），反应温度100℃，超声功率300 w，微波功率450 w。超声恒定模式进行超声微波合成。反应结束后，通过测定其接枝度来探讨反应时间对酪蛋白/花生分离蛋白糖基化改性的影响。

2.1.3缓冲溶液的pH对超声微波辅助制备糖基化产物的影响

称取一定量的酪蛋白/花生分离蛋白与壳寡糖（1:1 w/w）,溶解在一定量的磷酸盐缓冲溶液中，使得蛋白浓度为2 mg/mL。将混合溶液放置于磁力搅拌器上搅拌均匀，利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行合成。配置不同pH的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），反应温度100℃，反应时间30 min，超声功率300 w，微波功率450 w。超声恒定模式进行超声微波合成。反应结束后，通过测定其接枝度来探讨缓冲溶液pH对酪蛋白/花生分离蛋白糖基化改性的影响。

2.1.4质量比对超声微波辅助制备糖基化产物的影响

称取一定量的酪蛋白/花生分离蛋白与壳寡糖（2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、2:1 w/w）,溶解在一定量的磷酸盐缓冲溶液中（0.2 mol/L, pH=8.0），使得蛋白浓度为2 mg/mL。将混合溶液放置于磁力搅拌器上搅拌均匀，利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行合成。反应温度100℃，反应时间30 min，超声功率300 w，微波功率450 w。超声恒定模式进行超声微波合成。反应结束后，通过测定其接枝度来探讨壁材质量比对酪蛋白/花生分离蛋白糖基化改性的影响。

2.2 超声微波辅助干湿法联用制备最终糖基化产物

在湿法最佳条件下制备的糖基化改性蛋白溶液放置于透析袋中透析24 h，隔12 h换透析液，将透析的溶液样品拿去冷冻干燥24 h，冷冻干燥好的样品研磨成粉末并平铺于玻璃培养皿中。将玻璃皿放入干燥器内（含有饱和溴化钾、相对湿度79%，容器温度60℃）进行反应。酪蛋白1d，花生分离蛋白9d。反应结束后领冷却样品，并拿出真空干燥24 h，即可得干湿法联用制备的糖基化反应产物。

2.3糖基化产物接枝度的测定

糖基化反应是一种比较常用的对蛋白质进行结构功能改性的化学方法，蛋白质分子侧链上的氨基与多糖的羰基还原端发生糖基化反应，而未参与反应的即游离状态的氨基可以与OPA发生反应生成络合物，且在340 nm处有吸光度。通过吸光度的变化推测未参与反应的氨基含量。然后根据反应前后吸光度之差计算参与反应的氨基数量，从而得出接枝度的变化。

三、糖基化蛋白制备结果

项目研究采用超声和微波辅助干湿法联用制备糖基化蛋白符合壁材，在超声和微波共同辅助的条件下改性蛋白质，获得最佳符合壁材制备工艺，并对其进行结构表征，从而制备一种性能优良的新壁材用于活性物质叶酸的包埋。与传统微胶囊复合壁材相比，此类壁材原料成本更加低廉，其所获得的壁材综合性能更加完善，对提高活性物质叶酸包埋率和生物有效性及稳定性、降低微胶囊生产成本具有重要意义。

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