人肠道病毒动物模型研究进展

人肠道病毒动物模型研究进展

瞿颖 1，刘洪波 2

(1. 桂林医学院药学院 ,2. 桂林医学院第二附属医院 )

摘要：人肠道病毒多感染5岁以下儿童，可引起手足口病、病毒性心肌炎、无菌性脑膜脑炎等疾病，个别患儿病情加重时会发生死亡。人肠道病毒在世界范围曾多次感染爆发流行，受到人们的广泛关注。然而除脊髓灰质炎疫苗、新型肠道病毒71型灭活疫苗可预防脊髓灰质炎病毒、新型肠道病毒71型感染外，尚无特效药用于预防与治疗其他型别人肠道病毒感染，而缺乏具典型临床症状的动物模型在一定程度上限制了其抗病毒药物和疫苗的研发。本文就人肠道病毒动物模型最新研究进展展开综述。

关键词：人肠道病毒；感染；动物模型

人肠道病毒（Human enterovirus，HEV）属微小核糖核酸病毒目，小RNA病毒科，多感染5岁以下儿童，可引起手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD、无菌性脑膜脑炎（Aseptic meningitis，AM）、病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）等多种并发症，神经源性肺水肿（neurogenic pulmonary edema，NPE）、急性弛缓性麻痹（Acute flaccid paralysis，AFP）为其致死性原因^{[1, 2]}。HEV包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和新型肠道病毒。1962年，中国科学家顾方舟研制出口服的脊髓灰质炎减毒活疫苗（糖丸），使中国消灭了脊髓灰质炎病毒。2016年，新型肠道病毒71型灭活疫苗上市，大大减少了EV71的发病率，但其他型别HEV如柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）的感染率及发病率在不断的增加，受到世界的广泛关注^{[3, 4]}。目前无疫苗用于预防除脊髓灰质炎病毒、新型肠道病毒71型以外的其他型别HEV，尚无特效药物用于治疗其感染，研发疫苗及治疗药物至关重要，而构建动物模型是疫苗及药物研发等基础研究的有力评价平台。理想的动物模型应类似于人类自然感染病程及症状。近年来国内外研究者针对HEV特性研发了各个型别、不同种类的动物模型，相关动物模型主要为非人灵长类动物模型、小鼠模型，已在疫苗和药物评价中开展了相应的应用。本文就人肠道病毒动物模型最新研究进展进行综述。

1 新型肠道病毒动物模型

1.1 EV-A71动物模型

肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV-A71)对5岁以下的婴幼儿易感，主要引起HFMD，一般表现为发热，手、足、口腔疱疹等轻微症状，在部分感染者中可引发肺部及中枢神经性系统（CNS）并发症，严重可导致死亡^[5]。尚无针对 EV71 感染的特效药物，仅有EV-A71灭活疫苗用于防治其感染。已有研究表明EV-A71可感染恒河猴、食蟹猴等非人灵长类动物，但不能完全模拟感染后的临床病理症状，如EV-A71恒河猴模型虽可引起肺炎和CNS损伤，但手、足、口部未出现疱疹样皮肤损伤^[6]。此外，小鼠模型因其成本低、实验重复性好，广泛应用于HEV造模研究中。将临床分离株在乳鼠嗜性组织中连续传代，使病毒发生变异从而收获毒力增强的小鼠适应株，可解决临床分离株对小鼠不易感的关键性问题。Zhang等^{[7, 8]}用EV-A71小鼠适应株经口感染7日龄ICR乳鼠，乳鼠出现下肢麻痹、瘫痪、死亡等症状，病理显示肌肉组织大量坏死、脊髓和脑干出现神经元凋亡和丢失。Caine等^[9]建立了一个小核糖核酸病毒科感染的体内成像模型，可视化病毒在AG129小鼠体内的传播与分布，弥补了传统方法在病毒分布趋向中的不足，为HEV动物模型铺垫了一条可视化的新道路。

1.2 EV-D68动物模型

肠道病毒D组68型（Enterovirus D68，EV-D68）是引起急性呼吸道感染 （Acute respiratory infection，ARI）相关的病原体，其临床症状包括发热、咽喉痛、咳嗽及呼吸困难等，严重时还可出现CNS并发症如AFM^[10]。雪貂因其肺中含EV-D68 VP1的受体唾液酸，鼻内感染EV-D68后能出现流鼻涕、咳嗽等呼吸道症状，肺中炎性细胞因子高水平表达，最后引起NPE^[11]。此外，EV-D68的常用模型为小鼠模型。Sun等^[12]用拯救病毒EV-D68腹腔感染BALB/c 乳鼠，乳鼠出现与人类自然感染相似的肢体瘫痪、呼吸急促甚至死亡的症状，组织病理学、免疫组化及实时 PCR结果表明EV-D68对肌肉、脊髓和肺表现出强烈的噬性。该新生小鼠模型同时具有间质性肺炎和AFM的特性，证明EV-D68感染与AFM存在联系。

2 柯萨奇病毒动物模型

2.1 CV-A16动物模型

多项流行病学研究表明，柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）感染多引起轻症HFMD。由于感染机制的差异导致CV-A16疫苗的研发落后于EV-A71

^[13]。建立合适的动物模型是加快疫苗研制进程的关键因素之一。CV-A16猕猴模型的口腔粘膜和四肢均可出现特征性囊泡，与人类HFMD之间存在临床和神经病理学相似性^[14]。CV-A16乳鼠模型多表现为肢体麻痹、CNS损伤。徐等^[15]成功构建了CV-A16的 3 日龄 BALB/c 乳鼠模型，CV-A16对乳鼠的脑、肌肉、心脏表现出强烈的组织噬性。与以往的CV-A16模型相比，该模型进行了更深入的免疫、病理学研究，较为完整。Chen等^[16]用CV-A16鼻内滴注hSCARB2转基因小鼠，CV-A16表现出对hSCARB2转基因小鼠的肺及脑干的趋向性。该模型提示hSCARB2转基因小鼠可通过呼吸道感染CV-A16，可作为研究CV-A16相关呼吸系统和CNS疾病发病机制的模型。

2.2 CV-A10动物模型

柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10，CV-A10）主要引起HFMD，也可引发心肺功能障碍、AM等CNS疾病。近年来，CV-A10感染率和发病率逐渐增加，疫苗研发的同时也开展了相关动物模型的研究^[17]。目前CV-A10以乳鼠模型为主，尚无非人灵长类动物模型的相关报道。Zhang等^[18]用CV-A10 细胞适应株肌肉注射5 日龄ICR小鼠，小鼠活动减少、体重降低、四肢瘫痪，大脑、后肢、骨骼肌、肺出现明显病变。此模型模拟了CV-A10的CNS损伤特性，但无手足口皮疹症状。Liu等^[19]用拯救的CV-A10病毒感染一日龄ICR小鼠，小鼠出现严重的肌纤维断裂、肠绒毛间质水肿和严重的肺泡萎缩等病理改变。首次构建了CV-A10的感染性克隆小鼠模型，有利于模型毒株的保存和共享。

2.3 CV-A6动物模型

柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）自2013年来流行水平较高，且存在总体上升的风险，可导致HFMD、AM、AFP等疾病^[20]。根据目前的数据，CV-A6仅报道有小鼠模型。Yang等^[21]建立了第一个CV-A6新生小鼠模型，1 日龄 BALB/c 小鼠经腹腔和颅内感染CV-A6后出现真皮层囊泡、消瘦、后肢麻痹甚至死亡的临床症状，病理表明CV-A6对骨骼肌和皮肤有特殊的趋向性，对CNS则无噬性。该模型对皮肤的强烈趋向性可能与婴儿HFMD的临床特征有关。Qian等^[22]使用细胞适应的CV-A6病毒开发了主动免疫KM小鼠模型，CV-A6对14日龄的KM小鼠的四肢肌表现出强烈噬性，并可侵入CNS，引起严重的坏死和麻痹，提示CV-A6也可造成CNS损伤。蒋等建立了CV-A6的10日龄BALB/c小鼠致死模型，小鼠感染后产生了更高水平的 IFN-γ、IL-6 和 IL-10，可作为CVA6抗病毒药物和疫苗研究的临床前评价模型^[23]。

2.4 CV-A4动物模型

近年来柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus A4，CV-A4）在引起HFMD的病原体比例中快速升高，且呈现出广泛流行的趋势。CV-A4 感染后多数患者无症状或症状较轻，如非特异性发热或疱疹性咽颊炎，也可以引起AFP、AM等^[24]。Zhang等^[25]建立了首个 CV-A4 感染的 ICR 小鼠模型，3日龄新生小鼠感染后表现出后肢麻痹和死亡等临床症状，IL-6异常表达和IFN-γ/IL-4比例失衡诱发了严重的炎症反应，病理显示肌纤维和肌束断裂坏死、肺泡弥漫性损伤和中度炎症浸润。该模型证实了CV-A4全病毒灭活疫苗的高免疫原性，对临床评分、疾病发作和病程具有高度可重复性。目前CV-A4模型较为缺乏，仅有如上一个低日龄乳鼠模型，且不能完全模拟人类临床症状，存在一定的局限性，提示未来可建立不同特征的模型，为研究 CV-A4 的发病机制、评估疫苗的有效性和筛选抗病毒药物奠定基础。

2.5 CV-A2动物模型

柯萨奇病毒A组2型(Coxsackievirus A2，CV-A2)可引起HFMD、婴儿腹泻、疱疹性咽峡炎、心肌炎等，多数症状较轻、病程较短，且较少出现并发症但也有因重症HFMD而死亡的病例^[26]。Wang等^[27]建立了CV-A2的 5 日龄 BALB/c 小鼠模型，乳鼠感染后炎症细胞因子水平升高，出现了如共济失调、后肢麻痹和死亡等明显症状，发生肺出血、肌纤维溶解和心肌坏死等病理改变。此外，灭活的 CV-A2疫苗可以成功地在新生小鼠中产生免疫保护。该新生小鼠模型是研究CV-A2机制和开发CV-A2疫苗的有用工具。

2.6 CV-B5动物模型

柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5，CV-B5)多为无症状感染，少数患者可发展为HFDM、AM、VMC等疾病^[28]。作为非EV-A71和非CV-A16的HEV，CV-B5动物模型研究相对有限。MAO等^[29]建立了第一个致死性CV-B5的BALB/c小鼠模型，3日龄BALB/c小鼠感染后出现反胃、体重减轻、脱发，还表现出与在人类疾病中观察到的相似CNS 感染症状如颤抖、驼背、肢体麻痹，死亡。病理显示小鼠大脑皮层和整个脊髓、后肢肌肉和心肌细胞中的神经元细胞坏死。此模型验证了CV-B5灭活疫苗的体内保护性，具有良好可靠性和重现性，尤其适用于疫苗和药物评价。

2.7 CV-B2动物模型

流行病学调查显示，柯萨奇病毒B组2型(Coxsackievirus B2，CV-B2)可引起HFMD、AM，严重者可导致多器官感染^[30]。段等^[31]构建了CV-B2恒河猴模型，3-4个月的恒河猴感染CV-B2后表现出手、足、口、脑、心、肝、肾等多器官的病理损伤。提示猴体模型能反映一个较为完整的CV-B2感染过程和症状。Ushioda等^[32]建立的CV-B2小鼠模型，主要诱导新生小鼠脑损伤，手足口部位无明显疱疹。

2.8 CV-B3动物模型

柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3，CV-B3)是VMC的重要病原，也可引起HFDM^[33]。CV-B3模型主要为心肌炎小鼠模型。刘等^[34]建立了一个非致死的CV-B3小鼠模型，C57BL/6小鼠腹腔感染 CVB3 后逐渐出现进食减少、拱背、腹泻、倦怠及体重减少等症状，并伴随心肌炎性细胞浸润的病理改变，第 9d后逐渐恢复正常。与其他已构建的BALB/c小鼠模型相比，该模型非致死的原因除 C67BL/6 小鼠基因背景外，不排除小鼠周龄较大，免疫系统更为完善，且体重较稳定等其他因素的共同作用。

3．埃可病毒动物模型

埃可病毒（Enterocytopathogenic human orphan virus，ECHOV）感染呈全球性，感染后常表现为上呼吸道感染、发热、皮疹，容易引起AM和HFMD等。ECHO1、 ECHO6、 ECHO7、 ECHO9、 ECHO13、ECHO29 和 ECHO30 是引起HFMD的常见 ECHOV；AM病例中，ECHO6 和ECHO30 是优势血清型^{[35, 36]}。目前ECHOV相关研究多停留在基因特征分析和流行病学调查阶段，动物模型研究十分缺乏，提示未来学者可就此为研究方向，开发ECHO的相关动物模型，为ECHO相关疾病的疫苗及药物提供基础研究。

小结

HEV已经成为我国小儿急性传染性疾病的常见病原，传染力较强，传播途径广。构建能模拟人类感染病毒过程的动物模型是疫苗和针对性治疗药物研究的首要任务。已有动物模型主要为猴体、小鼠模型。猴体模型能够很好的模拟类似人类感染的症状，但其存在成本高等问题，不适合开展大规模的药物筛选研究。而小鼠模型繁殖能力强、容易饲养，且实验成本低，实验重复性好，可出现肢体麻痹、震颤、瘫痪等CNS症状，是适用于阐述HEV发病机制及评价疫苗预防效果和药物治疗效果的成熟动物模型。小鼠适应株虽可增强临床分离株对小鼠的易感性，但也易导致病理特征的改变。转基因小鼠模型可打破低日龄的限制，弥补传统模型在日龄上的不足。另外，可视化模型可以通过成像仪直观显示病毒在动物体内的分布情况，使疫苗在动物体内的保护情况一目了然，为疫苗的体内保护性研究提供了一条新的技术路线。

目前EV-A71、CVA-16、CV-A10、CV-A6均已开发出不同类型和特征的相关模型，并广泛应用于疫苗研发、药物筛选等多项研究中。而其它型别的动物模型较为单一或缺乏，在一定程度上限制了其致病机理和药物研究，还需学者们加以完善或补充。另外，尝试打破常规单一型别动物模型的局限性，利用转基因小鼠开发一个适用于多种HEV的通用模型，可作为多价疫苗的理想评价体系。

参考文献

1. 张蕾, 杨岩岩, 张秀娟. 2017-2019年河南省信阳市1697份手足口病病原监测分析. 河南预防医学杂志, 2021. 32(06): p. 436-439.

2. 郑志强, 周邦瑶, 叶环环, 等. 病毒性脑膜炎患者病原学流行特征回顾性分析. 中国卫生检验杂志, 2020. 30(14): p. 1775-1776+1780.

3. 陈亮, 何娟, 梁国新. 2015-2019年东莞市某镇手足口病流行病学特征分析. 职业卫生与病伤, 2021. 36(03): p. 156-159+163.

4. 曹梦露. 以大疱样皮疹为特点的手足口病病原学及临床特征分析. 2020, 苏州大学.

5. 阮旭琴, 吴雅妮, 李卉, 等. EV713C蛋白酶与ZMYM2相互作用及功能初探. 病毒学报: p. 1-10.

6. Zhang Y, Cui W, Liu LD, et al. Pathogenesis study of enterovirus 71 infection in rhesus monkeys. Lab Invest, 2011. 91(9): p. 1337-50.

7. Wang YF, Chou CT, Lei HY, et al. A mouse-adapted enterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oral infection. J Virol, 2004. 78(15): p. 7916-24.

8. Wang W, Duo JY, Liu YN, et al. A mouse muscle-adapted enterovirus 71 strain with increased virulence in mice. Microbes Infect, 2011. 13(10): p. 862-70.

9. Caine EA, Osorio JE. In Vivo Imaging with Bioluminescent Enterovirus 71 Allows for Real-Time Visualization of Tissue Tropism and Viral Spread. J Virol, 2017. 91(5).

10. Grifoni A, Mahajan S, Sidney J, et al. A survey of known immune epitopes in the enteroviruses strains associated with acute flaccid myelitis. Hum Immunol, 2019. 80(11): p. 923-929.

11. Zheng HW, Sun M, Guo L, et al. Nasal Infection of Enterovirus D68 Leading to Lower Respiratory Tract Pathogenesis in Ferrets (Mustela putorius furo). Viruses, 2017. 9(5).

12. Sun S, Bian LL, Gao F, et al. A neonatal mouse model of Enterovirus D68 infection induces both interstitial pneumonia and acute flaccid myelitis. Antiviral Res, 2019. 161: p. 108-115.

13. 田华平, 常伟琪, 陈璐, 等. 柯萨奇病毒A组16型纯化液超滤浓缩工艺的探索. 中国生物制品学杂志, 2020. 33(11): p. 1280-1284.

14. Wang J, Zhang Y, Zhang XL, et al. Pathologic and immunologic characteristics of coxsackievirus A16 infection in rhesus macaques. Virology, 2017. 500: p. 198-208.

15. 徐英莉, 郭姗姗, 耿子涵, 等. Cox A16型手足口病BALB/c乳鼠模型的建立. 中国实验动物学报: p. 1-9.

16. Chen YL, Li H, Yang JX, et al. A hSCARB2-transgenic mouse model for Coxsackievirus A16 pathogenesis. Virology journal, 2021. 18(1): p. 84.

17. 牛栋, 赵彬彬, 武婧, 等. EV71、CA16、CA10三价VP1蛋白疫苗的有效性和安全性研究. 中国实验动物学报, 2021. 29(02): p. 210-218.

18. Zhang ZJ, Dong ZP, Li J, et al. Protective Efficacies of Formaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Model of Coxsackievirus A10 Infection. J Virol, 2017. 91(13).

19. Liu QL, Dan HL, Zhao XP, et al. Construction and characterization of an infectious cDNA clone of coxsackievirus A 10. Virol J, 2019. 16(1): p. 98.

20. 李菲, 李娟, 张振杰, 等. 银花青蒿栀子方灌肠剂体内抗A6型柯萨奇病毒的作用及机制研究. 中草药, 2021. 52(12): p. 3576-3583.

21. Yang LS, Mao QY, Li SX, et al. A neonatal mouse model for the evaluation of antibodies and vaccines against coxsackievirus A6. Antiviral Res, 2016. 134: p. 50-57.

22. Qian SS, Wei ZN, Jin WP, et al. Efficacy of a coxsackievirus A6 vaccine candidate in an actively immunized mouse model. Emerg Microbes Infect, 2021. 10(1): p. 763-773.

23. Jiang ZX, Zhang YZ, Lin HY, et al. A 10-Day-Old Murine Model of Coxsackievirus A6 Infection for the Evaluation of Vaccines and Antiviral Drugs. Front Immunol, 2021. 12: p. 665197.

24. 冯昌增, 张名, 许丹菡, 等. 柯萨奇病毒A组4型分离株全基因序列分析. 中国病原生物学杂志, 2021. 16(05): p. 540-545.

25. Zhang ZJ, Zhang XC, Carr MJ, et al. A neonatal murine model of coxsackievirus A4 infection for evaluation of vaccines and antiviral drugs. Emerg Microbes Infect, 2019. 8(1): p. 1445-1455.

26. 禹玉婷, 胡岗, 罗志宇, 等. 柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定. 中国生物制品学杂志, 2021. 34(07): p. 782-787.

27. Ji WQ, Qin LW, Tao L, et al. Neonatal Murine Model of Coxsackievirus A2 Infection for the Evaluation of Antiviral Therapeutics and Vaccination. Front Microbiol, 2021. 12: p. 658093.

28. 张首富, 姚学君, 卢正祥, 等. 柯萨奇病毒B组5型分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式分析. 江苏预防医学, 2021. 32(03): p. 283-286.

29. Mao QY, Hao XT, Hu YL, et al. A neonatal mouse model of central nervous system infections caused by Coxsackievirus B5. Emerg Microbes Infect, 2018. 7(1): p. 185.

30. 杨亚平, 段素琴, 杨凤梅, 等. 柯萨奇病毒B组2型SYBR Green Ⅰ RT-PCR检测方法的建立. 贵州医科大学学报, 2020. 45(03): p. 315-320.

31. 段素琴. 人柯萨奇病毒B组2型恒河猴感染模型初步研究. 2019, 北京协和医学院.

32. Ushioda W, Kotani O, Kawachi K, et al. Neuropathology in Neonatal Mice After Experimental Coxsackievirus B2 Infection Using a Prototype Strain, Ohio-1. J Neuropathol Exp Neurol, 2020. 79(2): p. 209-225.

33. Wang H, Qian YJ, Qian CH, et al. Two Natural Recombination gave rise to the Coxsackievirus B3 GV that triggered outbreaks in China in 2006 - 2012. Infect Dis Now, 2021. 51(1): p. 81-85.

34. 刘宓, 高荣保, 韩俊. CVB3诱导的急性心肌炎C57BL/6小鼠模型转录组分析. 病毒学报, 2021. 37(03): p. 621-632.

35. 邱晓枫, 周银燕, 于新芬, 等. 杭州市儿童埃可病毒IgM抗体检测结果. 预防医学, 2021. 33(02): p. 168-169+173.

36. Wang K, et al. Structures of Echovirus 30 in complex with its receptors inform a rational prediction for enterovirus receptor usage. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 4421.