解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺

解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺

杨志伟 李闯 张良

江苏国信协联能源有限公司 江苏 宜兴 214200

摘要：本文通过试验探究的方式，以玉米清液为原料，以黑曲霉作为发酵菌株。通过单因素筛选的方式优化清液培养基，并根据产酸量、菌丝球形态等，对各项指标进行明确，实现柠檬酸产量最大化目标。根据试验结果可知，将初糖浓度设定为18%、采用分段通风转速控制方式，在发酵超过48h后可使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。与传统带渣发酵相比，产酸量与转化率得到显著提升。

关键词：玉米清液；柠檬酸；发酵生产

引言：粗玉米中蕴含着丰富的蛋白质，直接用其生产柠檬酸会使菌体飞速生长，对产酸造成严重阻碍。为避免这一情况，可将玉米粉液化后清楚残渣，液内蛋白质含量较低，利用清液发酵柠檬酸，不但可缩短发酵周期，还可提高转化率。当前，国内许多工厂已经陆续普及此种工艺，为提高玉米资源利用率，应对发酵生产工艺进行细致分析。

1试验材料与方法

1.1材料与仪器

本试验的菌株为黑曲霉；主要试剂为酵母粉、无水葡萄糖、FeSO4、玉米浆、a-淀粉酶，剂量为40000U/mL，肌醇；培养基为马铃薯葡萄糖琼脂、种子基础与发酵基础培养基；主要仪器设备为光学显微镜，型号为OLYMPU719068；电子天平，型号为FA2004N；总糖计，型号为WYT-J；恒温振荡器，型号为HZQ-QX；发酵罐，剂量为30L。

1.2试验方法

1.2.1初糖含量与柠檬酸产量关系

将清液中初糖浓度分别设定为16%、18%和20%，按10%接种量，在36.5℃、转速为400r/min、罐压为0.1MPa、通风为400L/h环境下发酵。在初始发酵时，每间隔8h分别从不同浓度罐体内取样，对液体PH值与柠檬酸产量进行测定，在放罐完毕后称取菌丝体净重，检测净重变化情况，并检测残还原糖值^[1]。

1.2.2还原糖测定

通过费林试剂热滴定方式，以亚甲基蓝作为指示剂进行测定。在空白滴定方面，分别吸取甲乙液体各5ml，放入250ml的锥形瓶内，滴入19ml左右的葡萄糖标准液，加热至沸腾，沸腾时间为30s，每2s滴入1滴，直至溶液蓝色消失，测定葡萄糖溶液的总体积，反复操作3次，记录平均值。在发酵液内还原糖测定中，分别选甲乙费林试剂各5ml，将其放入容量为250ml的锥形瓶内，利用吸管选取适当稀释后，将发酵滤液0.1ml放入锥形瓶内，再加入2滴甲基蓝，加热至沸腾后维持30s，快速从滴定管内加入样品溶液，当溶液变浅后，每2s滴1次，直至蓝色全部消失。此时记录溶液消耗体积，反复试验3次后取平均值，记为V2，公式如下：

式中，Q代表的是还原糖；V1代表的是空白滴定均值；V2代表的是发酵液还原糖滴定均值；n代表的是溶液稀释倍数；1000代表的是mg换算为g的数值。

1.2.3产酸量计算

产酸率是指柠檬酸的生产速率，单位为g，公式如下：

式中，D代表的是产酸率；t代表的是发酵时间，单位为h；Y代表的是柠檬酸计量，单位为g/100mL。

1.2.4培养基添加肌醇试验

在糖浓度为17%的清液中加入浓度分别为0、0.001%、0.003%、0.005%的肌醇。按照10%接种量，将温度设定为36.5%，转速为330r/min，摇床培养72h，每组试验两侧，以最后产酸量、菌丝球形态为因变量，对最佳肌醇量进行计算。

2试验结果

2.1玉米浆剂量确定

玉米浆属于最佳有机氮源，浆体浓度对柠檬酸发酵程度具有直接影响。经过测定得到最终产酸量、糖酸转化率，使浆体最佳浓度得以确定。根据试验结果可知，当浆体浓度为0.7%时，黑曲霉的产酸量达到最高，继续增加浆体后产酸量不发生改变。将产酸量、转化率综合分析后，选择0.7%玉米浆为培养基最佳氮源添加量。

2.2清液最佳发酵条件

在初糖浓度选择时，可采用不同浓度清液发酵处理，对柠檬酸产量进行测定，使残还原糖、固形物含量得以确定。根据试验可知，当初糖浓度为18%时，产酸量达到最大值，糖酸转化率达到最高，且残还原糖浓度较低。针对罐内固形物含量测定后，当初糖浓度超过18%，固形物含量将显著提升，因该项指标变化会影响下游提取，对多项因素综合分析后，将还原糖浓度确定为18%。

2.3肌醇浓度与发酵关系

将不同浓度肌醇加入到培养基内，对最终产酸量进行检测，并观察菌丝球形态，由此确定清液发酵培养基内最佳肌醇添加量。根据产酸量、糖酸转化率可知，通过加入适量的肌醇可有效提高产酸量，与未加入肌醇相比，发酵产酸量显著增加。根据试验结果可知，当肌醇添加量为0.007%时，产酸量与糖酸转化率可达到最佳状态。通过发酵完毕镜检图可知，没有加入肌醇的菌丝球丝扩散程度较大，菌丝球不够紧密。当添加量为0.007%的肌醇后，可发现菌球缠绕更加密实，能够向外延展的菌丝较少，且菌丝球形态较为完整，继续增加肌醇量后，产酸量固定不变，且菌丝球的一致性开始降低，菌丝扩散较大。综上，最后决定加入0.007%肌醇达到最佳浓度

^[2]。

2.4不同工艺对发酵的影响

在试验中采用不同工艺控制，可使发酵液内溶氧浓度产生较大差别，进而影响到最终发酵结果。在本试验中，方案A为分段式通风，方案B为大通风量。从发酵开始，每间隔8小时取样一次，对柠檬酸PH值、浓度等指标进行检测，记录好溶氧情况。根据试验结果可知，在0—16h期间，与分段通风相比，大通风下溶氧更佳；在16—64h之间，方案A的溶氧方式优于方案B。在方案B中，前期溶氧超高，容易使菌体增值过剩，使黑曲霉提早进入柠檬酸累积期，PH值降低速度过快，进而影响糖化酶活性，不利于原料充分利用，残还原糖含量提升，故而在发酵后期方案B中的产酸量落后于A。对此，采用方案A中分段式通风量进行深入探究。

在0—16h期间，将通风量控制为300L/h，菌体数量激增，溶液PH值测定为3.5，可使糖化酶始终保持活力，经过16h发酵后黑曲霉进入快速产酸阶段。在17—48h之间，通风量设定为450L/h，转速调整到450—500r/min，黑曲霉代谢加速，越来越多还原糖变为柠檬酸，且还原糖含量飞速降低，产酸量迅速提升。在48h发酵后，将通风量控制为350L/H，转速降低到300r/min，此时PH值处于稳定状态，残还原糖量为0.5%，柠檬酸产量为18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。在相同工艺下，玉米清液发酵水平为17.5g/100mL，转化率达到99.5%，说明清液发酵产量可超过带渣发酵。

结论：综上所述，大量实践研究表明，采用玉米清液发酵柠檬酸，可适当加入玉米浆为氮源，促进发酵液溶氧水平提升，加速糖酸转化。根据本文研究可知，在用玉米清液发酵生产柠檬酸时，为提高柠檬酸产量，将玉米浆液设定为0.7%，初糖浓度设定为18%，在分段通风控制条件下发酵超过48h，使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，与以往带渣发酵相比产酸率显著提升。

参考文献：

[1]孙荣.柠檬酸新型清液发酵工艺研究[J].山东轻工业学院,2019(06):012-014.

[2]潘声龙.玉米清液发酵生产柠檬酸的工艺研究[J].安徽农业科学院,2020(29):16700-16701.

作者简介：杨志伟（1974.12）；性别：男，民族：汉族  籍贯：江苏省宜兴人，学历：大专，毕业于南京理工大学；现有职称：中级工程师；研究方向：生物发酵。