观察金胺O荧光染色在结核病诊断中的应用效果

观察 金胺 O荧光染色在结核病诊断中的应用 效果

王萍

北川羌族自治县疾病预防控制中心 四川绵阳 622760

摘要 目的：观察分析金胺O荧光染色在结核病诊断中的应用。方法：2020年2月-2020年8月到北川羌族自治县疾病预防控制中心结核病控制科门诊就诊的患者755例，收集他们的痰标，同时用金胺O荧光染色法和抗酸染色法检测痰标本中结核分支杆菌，观察检测效果。结果：金胺O荧光染色组共检出84份阳性标本，阳性率为11.13%；抗酸染色组检出59份阳性标本，阳性率为7.81%。经检验，P＜0.05,两组间有统计学差异。结论：运用金胺O荧光染色进行结核病诊断，其诊断率更高，效果更理想。

关键词：金胺O荧光染色；结核病；诊断

由于流动人口骤增、HIV感染、耐药结核菌株蔓延，发展中国家贫穷加剧和对结核病控制的忽视，全球结核病疫情再次恶化^[1]。有抽样调查显示，绵阳地区15岁及以上人群肺结核的患病率为579/10万，高出全国平均水平26.1%（459/10万），属于结核疫情严重地区之一^[2]。 结核病实验室检查是为结核病的确诊提供病原学证据，也是确定传染性肺结核尤其是耐多药结核病的重要依据，是开展结核病疫情监测、治疗和防治效果评价的技术关键。目前结核病的实验室检测方法传统抗酸染色法、HE染色法、细菌培养法、荧光定量PCR法和斑点免疫层析法等。金胺O荧光染色法检测结核分支杆菌，效果比较理想，现将此项技术的开展应用情况报告如下。

1.材料与方法

1.1材料

（1）采集痰标本的容器 采用了可密封的、带螺旋盖的痰盒。

（2）采集时间和采集次数

痰标本的采集时间：即时痰、晨痰、夜间痰

痰标本的数量：初诊患者收集3份痰标本（即时痰、晨痰、夜间痰）；随访患者按期收集2份痰标本（晨痰、夜间痰）。

（3）标本 2020年2月-2020年8月到北川羌族自治县疾病预防控制中心结核病控制科门诊就诊的患者，初诊患者269例，随访患者486例，共755例。

1.2方法

同时用金胺O荧光染色法和抗酸染色法检测痰标本中结核分支杆菌。

（1）金胺O荧光染色方法

染色剂： 金胺O 1g溶于100ml 95%乙醇中，加石碳酸50ml，补蒸馏水至1000ml；

脱色剂： 35%浓盐酸5ml缓慢加入到95%乙醇95ml中；

复染剂： 0.5%高锰酸钾水溶液

步骤： 涂片制备，使用一端有磨砂面无划痕新玻片，经脱脂干燥，清洁后备用。用2B铅笔在磨砂面上注明标本序号；小心打开承载痰标本的盒子；仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05ml，于玻片右侧2/3处均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜；痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需30分钟）放置在染色架上；加热固定（在5秒钟内将玻片经过火焰加热4次）；滴加染色剂盖满玻片，染色15分钟，水洗；脱色剂脱色2-5分钟至无色，水洗；加复染剂复染1分钟，水洗；自然干燥后镜检。

（2）抗酸染色方法

滴加复红染色剂，加热，至出现蒸汽，3-5分钟后水洗。5%盐酸乙醇脱色至无红色，脱色时间不超过10分钟，脱色后水洗，加亚甲蓝复染30秒，水洗，室温下待干。

图1 图2

图1 金胺O荧光染色阳性，背景为暗色，结核杆菌为绿色荧光、弯曲的细杆状结构

图2 抗酸染色阳性，结核杆菌呈鲜红色、弯曲的细杆状结构

1.3统计学方法

采用SPSS15.0统计软件，配对χ²检验。

2.结果

2.1金胺O荧光染色显微镜检查

玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后镜检（宁波舜宇仪器有限公司EX30 LED荧光显微镜），首先以10×目镜、20×物镜视野下发现疑为AFB的荧光杆状物质，使用40×物镜确认。在暗背景下，AFB发出绿色荧光，呈杆状略弯曲（图1）。

2.2抗酸染色

阳性病例在40-100倍物镜明视野下，结核杆菌呈红色杆状，多数病例菌量不多，须仔细寻找才能发现（图2）。

2.3检测结果

2020年2月至2020年8月共收集755例初诊患者和随访患者。每份样品同时用金胺O荧光染色法和抗酸染色法检测痰标本中结核分支杆菌，结果见表1。金胺O荧光染色组共检出84份阳性标本，阳性率为11.13%；抗酸染色组检出59份阳性标本，阳性率为7.81%。经检验，P＜0.05,两组间有统计学差异。

表1 金胺O荧光染色法和抗酸染色法检测结果

3. 分析讨论

结核病实验室检查是为结核病的确诊提供病原学证据，也是确定传染性肺结核尤其是耐多药结核病的重要依据，是开展结核病疫情监测、治疗和防治效果评价的技术关键。目前结核病的实验室检测方法传统抗酸染色法、HE染色法、细菌培养法、荧光定量PCR法和斑点免疫层析法等。单纯依靠HE染色的形态特点和传统抗酸染色找到结核杆菌已不能满足工作要求，因为实际工作中结合病变形态有时不典型，需要其他疾病鉴别；细菌培养的敏感性和特异性较低，在临床早期诊断受到限制；荧光定量PCR法和斑点免疫层析法由于需要特殊的仪器设备，对实验室要求较高，难以在基层实验室开展。

结核病主要是由于患者感染了结核杆菌所引发，该病菌可能侵扰到各器官，但是以肺部较为典型，因此主要为肺结核。该病一年任何时间都会发生，其高发群体一般集中在青少年，疾病的潜伏时间在1-2个月，而疾病的传播主要通过呼吸道的人际传播为主，大多数疾病发病较为缓慢，只有少数病案属于急性发作。临床表现为咳嗽、低热、全身乏力或咯血等情况。疾病的检测方式上主要集中在突破镜下检测、X线、结核菌素检测等，其中痰涂片使用较为广泛。早期的及时诊断有利于其及时的干预治疗。一般早期病变可以有效得到遏制，而疾病发展到后期状况则会危及病患生命。初期治疗一般以药物干预就可以达到理想效果^[3-5]。

节约时间，提高工作效率。金胺O荧光染色和抗酸染色的原理相同，都是利用了结核杆菌的嗜石炭酸性，在染色剂中加入了石炭酸作为媒染剂。金胺O荧光染色阳性率高于抗酸染色，与国内外报道结果一致^[6-8]。通过一年多的实际操作，分析主要原因有三个方面：一是某些长期服用药物的患者结核杆菌的抗酸性被破坏，但荧光染色性仍保留，结果在抗酸染色中为阴性，而在金胺O荧光染色中为阳性。二是金胺O荧光染色中，亮绿色荧光的结核杆菌与背景对比明显，不易漏检；抗酸染色阳性的结核杆菌与背景对比不明显，容易漏检。三是抗酸染色操作繁琐，要在变通显微镜下长时间镜检，在100×物镜下寻找40个视野，容易造成视觉疲劳；而荧光显微镜低倍镜阅片，观察范围更大，在较短的时间内可以评估更多的视野，不易视觉疲劳，有明显优势。荧光染色只需要200×～400×的放大倍率，阅片需要大约2～3分钟时间，大大提高了工作效率。

质量管理。在检测环节上，要提升检测的有效性和准确性，让患者了解规范的取痰方式。同时标本取样的容器要保证相对的无菌化，不要让容器受到非痰液的物质的污染。标本采集后要进行及时的送检。结核杆菌痰涂片检验人员要对检验的涂片的制作、染色处理以及镜下检测环节做好标准操作，避免不规范操作对检测结果造成的误差，提升检测的整体水平。对于痰涂片检测人员要做好相关操作的培训工作，对其检测水平进行一定的保证。在疾病检测设备和检测环境进行一定质量管理，从而促进其检测质量的控制。

宣传防治。对相关疾病防治知识做必要的宣传，让民众对疾病有充分的认识，提升防御感染的能力，做好个人卫生管理，了解国家对与疾病防治的相关扶持政策，积极的进行疫情的预防性检测，提升疾病的检出率，避免疫情在患者不知情情况下的进一步扩散，让疫情得到有效的控制^[9-10]。

总体来说，金胺O荧光染色法检测结核分支杆菌操作简便、阳性率高、不需特殊仪器设备，便于基层单位开展。

参考文献

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[2]刘永明,李冬冬,朱思远,刘倩茜,陈其霞,安静娜,陶传敏.外周血白细胞中miR-29a作为肺结核生物标志物及其诊断价值[J].预防医学情报杂志.2018(10)

[3]李建华,张文龙,鲍玉成,商振德,邱南海.结核感染T淋巴细胞斑点试验在骨结核病诊断中的临床应用价值[J].中国实验诊断学.2018(10)

[4]苗素云,刘淑芳.三种检测方法对结核病诊断的临床价值[J].医学理论与实践.2017(19)

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