酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证

酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证

刘欣

石家庄高新技术产业开发区公司排水公司 河北 石家庄 050035

摘要：本文对《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》HJ1001 -2018、《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006进行了方法验证，以评价该两种检测方法是否适用于水中粪大肠菌群的检测工作，以确保该方法能够满足水中粪大肠菌群的测定。

关键词：粪大肠菌群；质控样品。

引言：试样与固定底物酶底物法（DST）采用大肠菌群能产生β—半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色的原理，来判断水样中是否含耐热大肠菌群，大肠菌群的培养温度是44.5℃。

1.测定方法与参数（注：方法为酶底物法法，参数为质控样品）

2.仪器与设备

2.1恒温培养箱

2.2冰箱

2.3高压蒸汽灭菌锅

2.4烘箱

2.5量筒

2.6吸管

2.7程控定量封口机

2.8 51孔或97孔定量盘

2.9无菌水样瓶（100mL）

2.10阳性比色盘

2.11干热灭菌器

3培养基和试剂

3.1无菌水

3.2科立德（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基。

4.样品的采集和保存

4.1采样前准备：

4.1.1采样瓶：高压灭菌瓶。

4.2样品采样及注意事项

4.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。

4.2.2在采集江，河湖，库，地表水时，可握住瓶子底部直接将采样瓶插入水中，约距水面10-15厘米时，瓶口朝来水方向，使水样灌入瓶内。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直至充满水样为止。采样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。采样后，采样瓶内上不应留有一些空隙，一边检验前充分混匀水样。

4.2.3从自来水龙头采集样品时，不要选用漏水的水龙头，采水前可先将水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌或用75﹪酒精溶液消毒水龙头，然后将水龙头打开，放水数分钟后除去水管中的滞流杂质。采水时控制水流速度小心接入瓶内。

4.2.4在同一采样点进行分层采样时，应自上向下进行，以免不同层次的干扰；同一采样点与理化检测项目同时采样时，应先采集细菌等检验样品，否则样品可能被污染，采样前，不得用水样刷洗采样瓶。

4.2.5采样完毕，应将采样瓶编号，做好采样记录。

4.2.6样品运输和保存

采集好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学检验，一般从采样到检验不宜超过4个小时，不然应使用10摄氏度以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6个小时，实验室接到送检样后，应将样品立即放入冰箱，并在2小时内着手检验。

4.3干扰与消除：防止操作过程中的污染，严格无菌操作。

5操作步骤

5.1水样稀释

检测所需水样为100ml。若水样污染严重，可对水样进行稀释。取10ml水样加入到90ml无菌水中，必要时可加大稀释度，水样按照10倍逐级稀释。

5.2 51孔或97孔定量盘

5.2.1用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入科立德培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。

5.2.2将前述100mL水样全部倒入51孔或97孔定量盘

中，用手抚平定量盘背面以赶除空穴内气泡，然后恋情程控定量封口机封口。放入 培养箱内培养24小时。

5.2.3 无需稀释检测范围： 1-24190MPN/100mL。

6结果报告

6.1结果判读

将水样培养24小时后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28小时后进行结果判读，超过28小时之后出现的颜色反应不作为阳性结果。

6.1.2 51孔或97孔定量盘法

6.1.2.1将培养24小时的水样定量盘取出观察，如颜色变成黄色则表示定量盘孔中含有总大肠菌群。若们法明显判别黄色孔格，则可借助97孔阳性比色盘比色判读。检测结果说明如下：

6.1.2.2计算有阳性反应的孔穴数，对照51孔或97孔定量盘

MPN表查出代表的总大肠菌群最可能数，结果以MPN/100mL表示。如果所有孔未产生黄色，则可报告总大肠菌群未检出。

6.1.2.3在无需稀释检测范围内直接嬮读出结果。若水中大肠菌群污染严重，超过定量范围（全部孔格显黄色）则需要稀释，读取结果后再乘以稀释倍数。

7质控

向一份100ml无菌水样中接种还有总大肠菌群的质控样标准菌株，按上述定性反应得操作步骤进行操作并观察结果。

采用爱德士公司批号为032619、032819的有证标准物质进行准确度验证。结果如下：

97孔定量盘

所
有测定结果均在可接受范围内。

参考文献：

《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》HJ1001 -2018

《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006

《环境监测分析方法标准修订技术导则》》HJ168-2010