不同温度对大豆糖蜜发酵法生产酒渣碱的影响研究

李文治

（无限极（中国）有限公司 广东广州 510600）

摘要：酒渣碱为一种强荧光黄色的化合物，具有淡苦味，是一种吲哚生物碱衍生物。酒渣碱具有抗HIV-1活性、抗癌活性、抗肿瘤活性、抗神经炎症活性等多种生理活性。本文以大豆糖蜜为原料，优化了米曲霉液体发酵生产酒渣碱的工艺条件。研究结果表明米曲霉在30℃发酵45d，发酵液中酒渣碱的浓度可达到0.45μg/ml。

关键词：酒渣碱 米曲霉 发酵

酒渣碱1936年第一次从日本米酒中发现，后来多次被科学家从当归、牛肝菌、酱油、高等植物和真菌中分离得到，并证明该化合物具有抗HIV-1活性，抗肿瘤活性。姚磊等人发现酒渣碱对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用；赵雪娇等从当归中分离纯化出酒渣碱；王洪平等从头花蓼中分离出酒渣碱；董泽军等人发现酒渣碱具有抗 HIV-1的活性，但是对C8166细胞的毒性比较弱，CC50为 87.86μg/mL，对 HIV-1 诱导 C8166 细胞形成合胞体抑制的EC50为 7.27μg/mL，治疗指数为 12.09；李冬梅等从真菌 Alternaria tenuissima SY-P-07 也分离出了此化合物。有鉴于此，本文以大豆加工副产物大豆糖蜜为原料，探讨米曲霉发酵法生产酒渣碱的工艺方法。

1实验材料与方法

1.1实验材料

米曲霉曲精 (Aspergillus oryzae)沪酿3.042，石家庄市鼎鑫酿造食品科学研究所；原料为大豆糖蜜、食盐，均为市购。酒渣碱（纯度98%）购于麦克林公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，美国Waters公司；HYP-308消化炉、KDN-103F型微量凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；pH-3E pH计，上海雷磁仪器厂；THZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；TG20-WS离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；Milli Q超纯水仪，默克密理博Merck Millipore公司。

1.3实验方法

1.3.1酒渣碱的制备方法

将大豆糖蜜与3倍水混合，121℃加热15min灭菌，接种0.05%的米曲霉进行28℃摇床培养40h后，将培养液与浓度为20%（w/w）食盐水以重量1：2混合，不同温度下发酵45d后，8000rpm离心3min去除沉淀，得发酵上清液；将发酵上清液与无水乙醇以1：6的比例进行萃取，萃取3次，8000 rpm离心15min，得离心上清液；将离心上清液放置3天，有结晶析出，去除结晶，取结晶上清液；将结晶上清液浓缩，真空冷冻干燥，干燥样即为酒渣碱。

1.3.2UPLC-MS/MS分析方法

色谱条件：Waters高效液相色谱仪，2998二极管阵列检测器；色谱柱：Agilent C18柱（150mm × 4.6 mm i.d., 5 μm,安捷伦，美国）；流动相为A：乙酸：水（5：95，v/v），B：甲醇，洗脱程序：0～30 min，B为10%～25%；30～60min，B为25%～40%；60～90 min，B为40～48%。流动相流速：0.7 m L/min；柱温：28°C；进样体积：10μL。检测波长：280nm。所有分析样品均经过0.45µm一次性针式样品过滤器过滤。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子模式，扫描范围为50-1400Da；离子源电压4500 V；雾化气氮气，流速60 L/h；干燥气温度350℃;二级质谱能量：CID 40。

2实验结果

2.1干燥样的质谱分析

将发酵得到的酒渣碱样品溶解于乙醇中，进行UPLC-MS/MS分析，结果见图1。由图1可见，酒渣碱的出峰时间为7.69min，分子量为309.0878Da。

图1 酒渣碱的一级和二级质谱

2.2不同发酵温度对发酵液中酒渣碱含量的影响

图2 发酵温度对酒渣碱含量的影响

由图2可见发酵温度对酒渣碱含量有较大的影响。随着发酵温度从20℃上升到30℃，酒渣碱含量从0.16μg/ml上升到0.45μg/ml，但进一步升高温度到40℃，酒渣碱含量降低到0.31μg/ml。由此可见，以大豆糖蜜为原料，接种0.05%的米曲霉在30℃发酵45d后，发酵液中酒渣碱的浓度可达到0.45μg/ml。

3结论

将大豆糖蜜与3倍水混合，接种0.05%的米曲霉进行28℃摇床培养40h后，将培养液与浓度为20%（w/w）食盐水以重量1：2混合，30℃发酵45d后，发酵上清液中酒渣碱的浓度可达到0.45μg/ml。

参考文献：

1. 姚磊,徐良雄,薛琛花,等.枝顶孢属真菌的抑菌活性及其代谢产物研究[J] 热带亚热带植物学报 2012, 20(2):192-196.

2. 赵雪娇,王海峰,赵丹奇,等.当归化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报.2013, 30(3)：182-185.

3. 王洪平,曹芳,杨秀伟,等. 头花蓼地上部分的化学成分研究[J].中草药. 2013, 44(1):24-30.

4. 董泽军，王飞，王睿睿，等. 点柄乳牛肝菌子实体中抗 HIV-1活性成分[J] 中草药. 2007, 8(3):337-339.

5. 费永和. 葵花籽的化学成分研究[D]. 苏州大学, 2014.

6. 李冬梅，武昕，季欣岑，等. 植物内生真菌Alternaria tenuissima SY—P-07次级代谢产物的研究[J].中国药学杂志. 2014, 49(6): 464-468.