益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞 PPAR－ γmRNA及蛋白表达的影响

益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞 PPAR－ γmRNA及蛋白表达的影响

李 冰

黑龙江农垦总局总医院 黑龙江哈尔滨 150088

摘要:目的:观察益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞PPAR－γmRNA及蛋白表达影响，探讨益气解毒活络中药有效成分防治糖尿病肾病的可能机制。方法:体外培养人肾小球系膜细胞株(GMC)，分为正常对照组，高糖高脂模型组、中药组(第1组、第2组、第3组)，qRT－PCR法检测各组24、48hPPAR－γmRNA的表达，WesternBlot法检测各组24、48hPPAR－γ蛋白活性的表达。结果:(1)各组24、48hPPAR－γmRNA表达比较:24h:与正常组比较模型组及中药配伍组均有显著差异(P＜0.01)，与模型组比较各中药配伍组PPAR－γmRNA表达均明显上升，且有显著差异(P＜0.01)，各中药配伍组组间比较发现第1组PPAR－γmRNA表达最高(P＜0.01)。48h:与正常组比较除去第1组未见明显差异(P＞0.05)，模型组及其余各用药组均有显著差异(P＜0.01);与模型组比较各中药配伍组PPAR－γmRNA表达均明显上升，且有显著差异(P＜0.01);各中药配伍组组间比较发现第1组PPAR－γmRNA表达最高(P＜0.01)。正常组24、48h两时间点PPAR－γmRNA表达未见显著差异(P＞0.05)，模型组及第1、2、3组48hPPAR－γmRNA表达显著高于24hPPAR－γmRNA表达(P＜0.01)。(2)各组24、48hPPAR－γ蛋白表达比较:GMC细胞24hPPAR－γ蛋白表达比较:模型对照组PPAR－γ蛋白低表达，各中药配伍组均能够调高PPAR－γ的表达，各中药配伍组组间比较发现第1组调高PPAR－γ作用最显著。GMC细胞48hPPAR－γ蛋白表达比较:模型对照组PPAR－γ蛋白低表达，各中药配伍组均能够调高PPAR－γ的表达，各中药配伍组组间比较发现第1组调高PPAR－γ作用最显著。结论:益气解毒活络中药有效成分可能是通过上调PPAR－γ表达水平的作用来保护受损的GMC，从而起到减缓糖尿病肾病病程进展，保护受损肾脏的作用。

关键词:益气解毒活络中药;糖尿病肾病;肾小球系膜细胞;PPAR－γ

糖尿病肾脏病(diabetickidneydisease，DKD)指的是由糖尿病引起的慢性肾脏损伤，目前已成为导致终末期肾衰的首位疾病，也是糖尿病患者的重要致死原因之一［1］。

人肾小球系膜细胞(HumanGlomerularmesangialcells，GMC)是肾小球固有细胞，占肾小球细胞群的35%左右。人肾小球系膜细胞是糖尿病肾脏病发展过程中主要受损的细胞，当受到多个介质影响时如纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、四型胶原蛋白(collagenIV，COLIV)、单核细胞趋化因子1(Monocytechemotacticprotein－1，MCP－1)、晚期糖基化终末产物(AGEs)等，与GMC相关联的信号转导通路以及氧化应激通路会被激活，如TGF－β信号通路、NF－κB信号通路以及PPAR－γ信号通路等，这些应答反应能够作为靶向治疗的靶点在临床治疗上起到作用［2］。前期研究证实，益气解毒活络中药组分配伍能够下调GMC细胞外基质FN、COLIV、MCP－1、TGF－βmRNA及蛋白水平表达，下调AGEs蛋白活性表达水平，并能够降低NF－κB蛋白的表达，进而抑制高糖高脂刺激的GMC增殖［3－5］。依旧采用人肾小球系膜细胞株(HBZY－1)为研究对象，并给予之前实验中选出效果最佳的益气解毒活络中药有效成分配伍组，分别对高糖高脂环境下GMC进行干预，观察益气解毒活络中药有效成分对高糖高脂环境下GMC细胞PPAR－γmRNA及蛋白表达情况的影响，结合之前实验结论探究益气解毒活络中药有效成分配伍防治DKD的可能机制。本实验是在前期实验基础上进行的验证性实验，依旧采用人肾小球系膜细胞株(HBZY－1)为研究对象，并给予之前实验中选出效果最佳的益气解毒活络中药有效成分配伍组，分别对高糖高脂环境下GMC进行干预，观察益气解毒活络中药有效成分对高糖高脂环境下GMC细胞PPAR－γmRNA及蛋白表达情况的影响，结合之前实验结论探究益气解毒活络中药有效成分配伍防治DKD的可能机制。

1方法

1.1细胞培养将肾小球系膜细胞(HMC)液氮冻存管置入37℃水浴中使其融化，用吸管将细胞悬混液移入100mL培养瓶中复苏后，加入完全培养液(DMEM+10mL/dL胎牛血清含100U/mL青、链霉素)。并将培养瓶放入5%CO2、37℃的培养箱中培养，每2～3d用0．04%胰蛋白酶消化传代，传代到第3～5代后进行实验。

1．2实验分组本实验分组是基于前期实验的结果，取效果最好的第1、2组及理论上最佳配伍A1B1C1D3盐酸小檗碱(低)黄芪甲苷(低)水蛭素(低)木樨草苷(高)为中药配伍组，以及正常组和模型对照组共5组。正常组:实验对照组(5．6mmol/L葡萄糖)，模型组:高糖高脂模型对照组(30mmol/L葡萄糖+20mg/LLPC)，第1组:盐酸小檗碱(低)黄芪甲苷(低)水蛭素(低)木樨草苷(高)，第2组:盐酸小檗碱(低)黄芪甲苷(低)水蛭素(低)木樨草苷(低)，第3组:盐酸小檗碱(低)黄芪甲苷(中)水蛭素(中)木樨草苷(中)。其中盐酸小檗碱高、中、低剂量分别为20、60、180μmol/L;黄芪甲苷高、中、低剂量分别为20、60、180μmol/L;水蛭素高、中、低剂量分别为0．5、1．5、4．5μmol/L;木犀草苷高、中、低剂量分别为60、180、540μmol/L。1.3指标检测WesternBlot法检测24、48h各组PPAR－γ蛋白表达;qRT－PCR法检测

3结果

3.1药组分配伍组均有显著差异(P＜0.01);各中药组分配伍组组间比较发现第1组PPAR－γmRNA表达最高(P＜0.01)且与正常组间无差异(P＞0.05)。

3.2GMC细胞24hPPAR－γmRNA相对表达量测定(图5)与正常组比较各组均有显著差异(P＜0.01);与模型对照组比较各组均有显著差异(P＜0.01);各中药正交组组间比较发现第1组PPAR－γmRNA表达最高(P＜0.01)。

3.3各组24、48h两时间点PPAR－γmRNA变化比较

正常组24、48h两时间点PPAR－γmRNA表达未见显著差异(P＞0.05)，模型组及第1、2、3组48hPPAR－γmRNA表达显著高于24hPPAR－γmRNA表达(P＜0.01)。

4讨论

目前，在世界范围内，随着糖尿病的患病率增高，DKD的患病率也日益增高，DKD严重影响了患者的正常生活，并且给人们带来很大的经济压力，已经成为一项严重威胁人类健康的世界性问题。现代医学对DKD的治疗尚缺乏特效药物，只能通过饮食控制、强化降糖降压、调整血脂及减少蛋白尿等给予对症处理，以延缓其进展，但疗效仍不理想。近年来，中医药在治疗DKD方面积累了丰富经验，并且形成了独特的理论和临床体系，我们发现TGF－β1高表达状态时，PPAR－γ表达下降，两者之间呈负相关，运用益气解毒活络中药有效成分能够有效提高PPAR－γmRNA及蛋白活性表达，抑制TGF－β1表达，从而起到抑制DN病程中炎症发生、肾小球纤维化以及脂代谢异常情况。然而，DKD发生发展相关的细胞通路错综复杂，益气解毒活络中药组分配伍可能是通过抑制TGF－β/NF－κB信号途径下调MCP－1、FN、COLIV、AGEs的表达及上调PPAR－γ表达水平的作用来保护受损的GMC，从而起到减缓DN病程进展，保护受损肾脏的作用。

参考文献

［1］中国2型糖尿病防治指南(2013年版)［S］．中国糖尿病杂志，2014，22(8):2－42．

［2］LanHY．perserolesofTGF-beta/Smadsinrenalfibrosisandinflammation［J］．IntJBiolSci，2011，7(7):1056－1067．

［3］辛彩虹，李敬林，郑洪新，等．益气解毒活络中药有效成分对高糖刺激人肾小球系膜细胞增殖分化及ColIV、MCP－1mR-NA和蛋白表达影响［J］．辽宁中医杂志，2017，44(3):566－570．

［4］辛彩虹，李敬林，郑洪新，等．益气解毒活络中药有效成分对高糖高脂刺激人肾小球系膜细胞增殖分化及FN、TGF－βmRNA和蛋白表达影响［J］．中华中医药学刊，2017，35(4):810－814．