碳酸氢钠注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的 HPLC法分析

碳酸氢钠注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的 HPLC法分析

黄凤华 * 赵清 张瑜 侯宁 吴俊文

天津金耀药业有限公司，天津 300457

摘　要：利用高效液相色谱法对碳酸氢钠注射液中乙二胺四乙酸二钠（Disodium ethylenediamine tetraacetate, EDTA-2Na）的含量进行定量分析。采用艾杰尔Venusil XBP C₁₈(L)(4.6x250mm，5µm)色谱柱，流动相为12.5%乙腈：0.052%甲酸水溶液（四丁基氢氧化铵调节pH至4.0）（v/v) ，流速1.0 mL/min，紫外检测器波长258nm, 柱温35℃，进样量20 μL。结果表明EDTA-2Na的浓度在0.042 mg/ml ~0.078 mg/ml浓度范围内线性关系良好 (R= 0.9998 )，高 、中、低 3 种不同浓度平均回收率 (n=9) 为100.38% ( RSD = 0.59 % ) ,采用正交试验法优化反应条件，使其系统适用性良好，理论塔数可以达到12078，与氯化铁峰无干扰，反应过程无沉淀。该方法具有快速，准确度高、选择性强、重现性好、不受其他成分干扰等特点，适应用于碳酸氢钠注射液中EDTA-2Na的分析。

关键词：碳酸氢钠注射液、乙二胺四乙酸二钠、高效液相色谱法、正交试验设计

碳酸氢钠注射液是调节电解质、水盐及酸碱平衡的药物，临床多用于治疗代谢性酸中毒，碱化尿液，预防尿酸性肾结石^[1]。本品的主要成分是碳酸氢钠，辅料为乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。查阅各国产品发现处方中EDTA-2Na的含量不尽相同，这就意味着EDTA-2Na含量研究是碳酸氢钠注射液处方研究的重点内容。

近年来，随着科技水平的提高，国家药品审评中心对各种辅料的控制提出了更为严格的要求，对EDTA-2Na作为金属离子螯合剂使用的量要求越来越高，碳酸氢钠注射液中EDTA-2Na的浓度控制已经成为注射液质量评价的重要指标和提高药品质量的重要手段^[2]。

国内外测定药品中EDTA-2Na含量的文献报道多采用薄层色谱法、离子色谱法、滴定法和比色法^[3]，但是EDTA-2Na在碳酸氢钠注射液中含量极低，上述方法精确度低、选择性差。

本文通过优化EDTA-2Na与铁离子形成络合物的反应条件，建立碳酸氢钠注射液中EDTA-2Na含量HPLC检测方法。该方法不仅可以为该品种质量评价提供科学依据，而且还可以为临床使用提供重要参考。

1 材料与方法

1.1仪器及试药

Agilent HPLC 1260 Infinity II （安捷伦 1260 Infinity II 高效液相色谱仪）；DEAE203882 DEAE204438 (泵) ；DEAC604308 DEACX08731 (紫外检测器) ；DEAEQ15866 DEAEQ17932(自动进样器及柱温控制器)；Agilent OpenLab化学工作站；XS105 METTLER TOLEDO分析天平 (梅特勒有限公司，万分之一) ；超声波清洗(ULtrasonic Cleaner Model C9860A) ；赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，酸度计。

EDTA-2Na标准品，中国计量科学研究院；碳酸氢钠原料，天津市光良科技发展有限公司生产；色谱纯乙腈，天津安徽时联有限公司；盐酸、甲酸、氯化铁、四丁氢氧化铵均为市售分析纯。碳酸氢钠注射液（规格为10 mL：0.5 g），天津金耀药业有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 色谱条件及系统适用性试验

艾杰尔Venusil XBP C18(L)(4.6x250mm，5µm)色谱柱；流动相：12.5%乙腈：0.053%甲酸水溶液（四丁基氢氧化铵调节pH至3.5）（V：V）；紫外检测器波长258nm；流速：1.0 ml/min；柱温：35℃；分析时间：15min。在上述色谱条件下，EDTA-2Na标准品进样20 μL，EDTA-2Na保留时间为8.5min。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1空白氯化铁溶液

取5mL水，置20mL量瓶中，加入经盐酸酸化后的氯化铁溶液1mL反应，用水溶解定容，摇匀，经水相滤膜（0.45μm）过滤即得。

1.2.2.2对照品溶液

取EDTA-2Na对照品约30mg，精密称定，至100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取10ml至50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液5ml至20ml量瓶中，加入经酸化后氯化铁溶液1ml反应后用水溶解定容，摇匀，经水相滤膜（0.45μm）过滤即得。

1.2.2.3供试品溶液

精密量取本品5ml至20ml量瓶中，滴加0.5mol/L盐酸溶液6ml，边滴加边振摇，超声脱气后，加入经酸化后氯化铁溶液1ml反应后用水溶解定容，摇匀，经水相滤膜（0.45μm）过滤，即得。

2 结果与讨论

2.1络合反应条件选择

2.1.1正交试验因素及水平的选择

氯化铁络合剂需酸化后才能与EDTA-2Na络合，文献中的影响酸化效果的因素有反应时间、酸化氯化铁所需盐酸的加入量、氯化铁的浓度，影响因素多而且变量多^[4]。应用统计学的知识，设计正交试验，合理安排试验，取得数据，进行综合科学分析，从而尽快获得最优组合方案。

2.1.2正交试验

根据文献中提到的因素和变量进行正交试验方案设计如下，正交试验设计表见表1，试验结果见表2。从计算结果可以看出:A:K₃>K₄>K₁>K₂; B:K₃>K₂>K₄>K₁; C:K₃>K₁>K₄>K₂; R_A>R_C>R_B。所以，确定最佳反应条件为：反应时间20分钟，酸化氯化铁所需0.5mol·L^-1盐酸的加入量为10mL，氯化铁浓度0.8%。

表1正交试验因素表

Tab. 1 Table of orthogonal experimental factors

表2正交试验表及结果

Tab. 2 The effect of Orthogonal test and result

2.2测定条件的方法学考察

2.2.1专属性试验

精密量取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，记录色谱图见图1，结果表明乙二胺四乙酸二钠峰不受氯化铁干扰。

图1供试品中EDTA-2Na的色谱图

Fig 1 Liquid chromatogram of EDTA-2Na in sample

2.2.2检测浓度的线性关系

分别配制浓度为0.042 mg/ml、0.048 mg/ml、0.054 mg/ml、0.060 mg/ml、0.066 mg/ml、0.072 mg/ml、0.078 mg/ml的EDTA-2Na对照品溶液，进行络合反应后进样量20 μL，根据峰面积与对照品溶液浓度绘制曲线图，见图2。标准曲线表明，EDTA-2Na 的含量在0.042 mg/ml ~0.078 mg/ml的范围内线性关系良好。经计算，其相关系数为0.9998，标准工作曲线的回归

方程为y = 7079.14662x – 1.07623。

图2 EDTA-2Na在0.042 mg/ml ~0.078 mg/ml 范围内HPLC标线

Fig 2 The standard curve of EDTA-2Na for HPLC with 0.042 mg/ml ~0.078 mg/ml

2.2.3精密度和准确度的分析

2.2.3.1准确度分析

分别配制不同浓度的EDTA-2Na对照品溶液，加入碳酸氢钠原料，分析测定的结果见表3。平均回收率为100.38%，RSD = 0.59%，符合分析要求。

表3方法的回收率测定

Tab 3 The determination of recovery rate

2.2.3.2精密度分析

建立的分析方法精密度RSD为0.79%，见表4，表明该方法具有准确、快速的特点。

表4精密度分析结果

Tab 4 The determination of precision degree

2.2.4耐用性及溶液稳定性

2.2.4.1耐用性试验

对不同柱温、流速、波长、流动相比例、流动相PH、色谱柱对样品进行检测，结果见下表。由此可见，使用该方法检测碳酸氢钠注射液中EDTA-2Na的耐用性良好。

表4耐用性试验结果

Tab 4 The determination of precision degree

2.2.4.1溶液稳定性试验

对照品溶液和样品溶液分别取0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h时间进样，结果显示对照品溶液和供试品溶液中主峰峰面积在24小时内的RSD值均小于2.0%。对照品溶液和供试品溶液稳定性良好，可以满足含量测定的要求。

2.2.5最低检测限和定量限

取对照品溶液约为60.34μg·mL^-1浓度的EDTA-2Na溶液，用稀释法测定检测限及定量限，按S/N =3计算，EDTA-2Na的检测限为50ppm，按S/N = 10计算，其定量限为300ppm。

3结 论

EDTA-2Na由于其结构特点，没有紫外吸收，根据其易与金属离子螯合，形成稳定的水溶性螯合物的特性可进行高效液相色谱法测定

^[5]。本文通过对EDTA-2Na与铁离子形成络合物进行测定，来研究碳酸氢钠注射液中EDTA-2Na含量测定的方法学。应用正交试验设计方法最终确定EDTA-2Na与铁离子形成络合物的反应条件，采用艾杰尔Venusil XBP C18(L)(4.6x250mm，5µm)色谱柱，以12.5%乙腈：0.052%甲酸水溶液（四丁基氢氧化铵调节pH至4.0）（v/v)为流动相，在1.0 mL/min的流速下测定EDTA-2Na，具有灵敏度高、选择性强、重现性好、不受其他成分干扰等优点。本法的重现性好，平均回收率达到100.38%，在0.042 mg/ml ~0.078 mg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系。

参考文献：

[1 ]Seki J T, Wang T Q, Yip P M, et al. Stability of sodium bicarbonate injection 8.4% in syringes over a six-week period in refrigerated temperature[J]. J Oncol Pharm Pract, 2018, 24(3):198-200.

[2] 耿志旺, 刘蔚, 刘茜, et al. HPLC法测定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量[J]. 药物分析杂志, 2011(3):586-588.

[3] 张婷婷, 潘广文, 胡忠阳, et al. 在线预处理对乙二胺四乙酸二钠离子色谱分离的影响及其应用[J]. 分析化学, 2012, 40(5):813-814.

[4] 李增礼, 周乐春, 赵辉, et al. 高效液相色谱法测定重组人干扰素α-2b注射液中乙二胺四乙酸二钠含量[J]. 生物技术通讯, 2012, 23(3):419-422.

[5] 黄建, 李文仙, 霍军生. 反相离子对高效液相色谱法测定果味饮料中的乙二胺四乙酸二钠[J]. 中国食品工业, 2009(6):55-56