肿瘤中可变剪切的调控机制及作为治疗靶点的意义

肿瘤中可变剪切的调控机制及作为治疗靶点的意义

余玲

浙江大学医学院附属儿童医院肾脏内科，浙江 杭州 310003

【摘要】mRNA可变剪切是一种常见的基因表达调控机制，其异常调控与肿瘤发生发展密切相关。多种机制可以导致可变剪切变化，包括基因在发生剪切位置发生突变、剪切因子本身突变或表达异常以及肿瘤细胞中系统性的剪切异常。可变剪切的变异可以造成抑癌基因不表达或诱导特定的促癌蛋白形成。同时，这类剪切也可以成为肿瘤治疗的靶点。目前已经有多种小分子化合物可以靶向抑制可变剪切，在临床前研究中证实具有有效的抗癌作用。进一步的研究需要对可变剪切异常所造成的肿瘤生物学功能影响做进一步的认识，以及靶向可变剪切针对特定肿瘤患者，特别是存在剪切因子突变患者中的治疗效果。

【关键词】可变剪切；剪切因子；突变；肿瘤

在基因表达的过程中，信使RNA（messenger RNA, mRNA）前体剪切成为成熟的mRNA至关重要。剪切的主要目的是去除非编码内含子区域，通过由多种蛋白和RNA组成的剪切体完成。由于多数基因都具有多个交叉的外显子和内含子，同一基因不同的内含子剪切方式可以导致最终翻译产生不同的蛋白质。这种mRNA前体剪切的极大灵活性也被称为可变剪切（alternative splicing, AS），它能够极大地扩展细胞的蛋白组表达种类。尽管大多数由于AS所产生的蛋白亚型功能尚不明确，但有研究指出特定的蛋白质亚型可能参与肿瘤的发生和进展^[1]。

肿瘤细胞中已发现有多种机制可以导致异常的可变剪切。首先，mRNA剪切位置附近对应的基因位点上发生变异，从而诱导剪切错位^[2]。其次，转录组分析发现肿瘤中广泛存在整体性的剪切异常，例如无法有效移除内含子^[3]。最后，编码剪切体相关蛋白的基因发生突变，这类突变在某些肿瘤中发生的频率较高，直接导致剪切过程错乱或无效^[4]。本文将讨论各种可变剪切异常的调控以及对肿瘤的生物学影响，以及剪切作为潜在肿瘤治疗靶点的可能性和研究现状。

1. RNA可变剪切的调控

RNA剪切是通过剪切体这一大分子复合物实现的，剪切体中包含多种小核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein, snRNP），每种snRNP都拥有一个对应的非编码RNA和一个Sm或类Sm蛋白复合体^[5]。内含子的剪切是通过识别mRNA前体上的短序列模体，特别是在上游外显子和内含子交界处（5’剪切部位）以及内含子和下游外显子交界处（3’剪切部位）。不同的snRNP在剪切过程中发挥各自的功能，U1 snRNP负责识别并结合至5’剪切部位，而U2 snRNP在U2辅助因子（U2 auxiliary factors, U2AFs）的参与下可以与3’剪切部位附近的分支点区域相互作用。随着U4/U6/U5 snRNP被募集，组装成的剪切体变为活化的构象，并通过两次连续的酰基转移反应完成剪切^[6]。

事实上，可变剪切处于一种动态变化的状态。不同细胞中相同基因的剪切方式可能不同，同一个细胞在受到不同的刺激下剪切类型也会发生改变。随着高通量测序技术的不断发展，对于RNA剪切的定量检测可以做到更为快速和准确的评价。

同时，可变剪切也受到反式作用剪切因子的调控，这些反式作用因子能够结合到相应的模式序列上来增强或减弱剪切，其中最主要的包括富丝氨酸/精氨酸蛋白（serine/arginine-rich proteins, SR蛋白）和核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs）。它们都具有在氨基端的RNA识别模式区域和碳端负责蛋白之间结合的区域。传统认为SR蛋白和hnRNPs分别促进和抑制剪切，但最新的研究显示它们与mRNA前体之间的结合取决于环境因素，具有复杂的相互调控关系，在不同的刺激条件下对剪切的作用会完全相反。此外，质谱检测结果显示剪切体与超过170种蛋白质相结合，而生物信息学分析证实外显子中至少有上百个模式序列负责调控剪切。因此，mRNA的剪切是一个涉及多种蛋白质、RNA相互调控的负责生物学过程。

2. 肿瘤相关可变剪切的异常调控机制

1.1 剪切位置序列对应基因位点的变异

大规模的RNA测序数据显示肿瘤与对应的正常对照组织之间在RNA加工过程存在巨大差异。其中，几乎所有的肿瘤都具有内含子保留异常，频率远高于其它类型的剪切改变，包括盒式外显子剪切、5’或3’剪切部位识别。两项较新的研究在整合了同一肿瘤患者的全外显子、全基因组和RNA测序的数据后发现大量体细胞突变可以直接影响RNA剪切，而这些单核苷酸变异更倾向于诱导内含子保留。同时这种内含子保留更多发生在抑癌基因中，因为几乎所有这种内含子保留都导致终止密码子形成。受到影响的常见抑癌基因包括TP53

、ARID1A和PTEN等。相反，在癌基因中由于碱基变异导致的剪切异常则经常诱导该基因活化。例如，肺癌中特定突变诱导MET基因14号外显子被异常剪切所去除，所形成的MET蛋白在靠近细胞膜的区域缺失，增强MET受体信号通路激活。而NOTCH1基因突变所导致的隐蔽剪接位点活化，在慢性淋巴细胞白血病中可以诱导异常激活的NOTCH1蛋白^[7]。

1.2 剪切体相关基因突变

除了基因突变直接导致基因相关剪切位点异常之外，剪切体中相关因子的突变则可以在更大程度上影响mRNA剪切。目前研究报道较多发生突变的剪切因子包括SF3B1、U2AF1、SRSF2以及ZRSR2 ^[4]。起初，这些突变是在血液系统肿瘤中被发现，如骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病，随后在实体瘤中也发现了相关基因的突变。在不同肿瘤类型中，相关基因的突变频率和变异位点存在较大差异，提示其所导致的功能改变并不相同。但是，该类基因突变的特征提示它们很可能是参与肿瘤发生和进展的关键因素。首先，除ZRSR2外，SF3B1、U2AF1和SRSF2基因突变均以杂合子的形式导致高度集中的个别氨基酸位点发生改变，提示它们很可能会引起功能获得或改变。其次，不同剪切因子突变并不同时存在，可能是由于功能冗余或协同致死。

1.3 剪切相关调控蛋白表达异常

在不存在特定基因突变的情况下，剪切相关基因表达水平的变化也可以改变正常剪切过程，从而影响肿瘤的生长。某些SR蛋白过表达后发挥促癌作用。例如剪切因子SRSF1在肺癌、乳腺癌和结肠癌细胞表达上调。在小鼠正常乳腺上皮细胞中轻度过表达SRSF1就可以诱导细胞永生化，研究发现其促进细胞转化是通过诱导MNK2和S6K1基因的剪切异常，激活mTOR通路。hnRNPs表达异常也与肿瘤密切相关。有两项研究报道在胶质瘤中MYC介导的特定hnRNPs上调可以导致PKM基因的9号外显子被排除，促进了肿瘤相关PKM胚胎亚型的表达和有氧糖酵解。而EGFR的持续活化亚型EGFRvIII能够上调hnRNP A1的表达，导致MAX可变剪切形成Delta MAX，促进糖酵解相关基因表达和胶质瘤细胞增殖。最新的一项研究发现，B细胞急性淋巴细胞白血病中SRSF3表达异常可以引起CD19剪切状态改变，导致靶向CD19的CAR-T治疗失效。

3. 靶向RNA剪切的肿瘤治疗策略

考虑到可变剪切在肿瘤中的重要作用以及剪切因子在某些肿瘤中存在突变，因此研究人员猜测干预剪切调控可能具有抗肿瘤效果。目前，有多种化合物抑制剂可以靶向RNA剪切，其中作用于核心剪切体形成的药物研究最多，它们均通过结合到U2 snRNP上的SF3B来干扰早期剪切体的组装，包括pladienolide、spliceostatin A和sudemycin以及其类似物，优化合成技术后还产生了E7107等在化学稳定性方面更好的药物类型。这类药物作用于细胞后会导致大量非剪切的mRNA前体在核内聚集，只有少部分未剪切的mRNA前体进入胞浆翻译为异常的蛋白产物，从而影响肿瘤细胞的存活和生长。

目前肿瘤中所发现的剪切因子突变均表现为杂合子，而研究证实其中野生型的等位基因对维持细胞存活至关重要。因此，靶向剪切的药物在剪切因子突变的肿瘤中会具有更好的治疗效果。例如，在小鼠白血病模型中，E7107对SRSF2突变小鼠的肿瘤细胞杀伤作用更强^[8]。同样，SF3B1和U2AF1突变的肿瘤细胞对这类抑制剂更敏感。由于在临床前研究中具有良好的效果，E1707已经开展针对局部进展和转移实体瘤的I期临床试验。

除了针对剪切因子突变的肿瘤具有潜在的治疗效果外，研究发现这类药物可能对依赖MYC基因的肿瘤亚型具有更好的疗效。MYC被认为是影响肿瘤的一个关键癌基因，部分肿瘤的生长和进展依赖MYC。一项研究发现，在MYC过表达的乳腺上皮细胞中，增强的可变剪切活动对于维持细胞存活必不可少，可能是由于MYC激活导致大量mRNA前体合成，需要相应增强的剪切来产生足够的蛋白产物。抑制剪切调控蛋白BUD31的表达对这类细胞存在协同致死效应。同时，对MYC活化的乳腺癌荷瘤模型给予sudemycin D治疗可以显著抑制肿瘤生长^[9]。此外，MYC还可以直接上调snRNP组装调控基因Prmt5的表达促进可变剪切^[10]，MYC依赖的肿瘤细胞通过调控可变剪切来诱导特殊PKM蛋白亚型产生，这些现象都提示靶向RNA剪切是治疗依赖MYC的肿瘤的一种潜在策略。

此外，正如增加的体细胞突变负荷可以产生新抗原表位并使得肿瘤对免疫治疗敏感一样，可变剪切的异常调控也能够导致异常mRNA和新抗原表位的产生。因此，存在剪切因子突变的肿瘤是否是判断免疫治疗敏感性的一个指标值得进一步的研究。

4. 总结

肿瘤中存在显著的可变剪切异常调控，包括剪切因子的突变、相关调控蛋白的表达异常等，这些生物学过程都可能参与肿瘤的发生和进展。但是目前对变异所导致的具体剪切位置和外显子识别的改变尚缺乏足够的认识，而且对特定因子变异所造成的肿瘤生物学功能变化没有深入的研究。相同的变异在不同肿瘤中可能具有差别的作用，而不同的因子或突变位点很可能对功能学的影响存在差异。另一方面，可变剪切可能成为肿瘤治疗中的一个有效靶点，临床前研究已经提示靶向剪切的药物具有抗肿瘤作用。特别是随着精准医疗的发展，对特定剪切因子变异的鉴定能够筛选出对该类药物敏感的肿瘤亚组患者。

【参考文献】

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