原花青素对瘦肉精染毒小鼠精子质量损伤的修复作用

原花青素对瘦肉精染毒小鼠精子质量损伤的修复作用

陈白莲 李苹 高秀丽 刘芳 雷媛娣 邹学敏

长沙医学院公共卫生学院，湖南长沙 410219

摘要 目的 探讨原花青素（PC）对瘦肉精（CL）染毒小鼠精子质量损伤的修复作用。方法 选择50只SPF级成年雄性小鼠按体重随机分为5组：溶剂对照组、CL染毒组、低、中、高剂量PC保护组。CL染毒组按31.5mg/kg.bw剂量灌胃CL溶液；低、中、高剂量PC保护组在灌胃同剂CL的基础上分别按100、200、400（mg/kg·bw）剂量灌胃PC溶液。除对照组灌胃等体积的蒸馏水外，其它每组均上午灌胃CL、下午灌胃PC，每天1次，实验时间均为6周。实验结束后处死动物，分离双侧睾丸其附睾测定相关指标。结果 CL染毒组小鼠睾丸和附睾脏器系数均低于对照组及中、高剂量PC保护组（P<0.05）；与对照组比较，CL染毒组小鼠精子数减少，精子的死亡率、畸形率增加（P<0.05）；与CL染毒组比较，经中、高剂量PC保护后，小鼠精子数均有增加，精子的死亡率、畸形率均有明显减少（P<0.05）；与对照组比较，CL染毒组小鼠睾丸组织SOD活性降低，MDA含量增加(P＜0.05)；与C L染毒组比较，中、高剂量PC保护组小鼠睾丸组织SOD活性提升，MDA含量下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 瘦肉精对小鼠睾丸组织及精子质量其酶有损伤作用；一定剂量的PC对CL损伤的睾丸组织及其精子有修复作用，其作用机制可能与抗氧化损伤有关。

【关键词】原花青素；瘦肉精；雄性小鼠；睾丸；精子；抗氧化

盐酸克伦特罗（CL）是一种人工合成β-肾上腺受体激动剂，因它具有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的作用，俗称“瘦肉精”^[1]。 CL曾主要用于治疗哮喘等呼吸系统疾病，后研究发现CL能提高饲料转化率和牲畜的瘦肉率，曾广泛应用于畜牧业。由于CL在体内化学性质与结构稳定，在动物体内吸收快、代谢慢、易残留，人类长期食用含有瘦肉精的肉类会对人体造成各种侵害，如慢性毒性，免疫、发育以及致癌、致畸、致突变等病变^[2]。原花青素（PC）是植物中广泛存在的一大类多酚类聚合物的总称。广泛存在于葡萄、苹果、山楂、樱桃等植物中，其中以葡萄籽和皮含量最为丰富^[3]。近年来研究发现, PC具有抗氧化、抗炎、抗突变、降低血液胆固醇、减少心脑血管疾病的发生、延缓衰老、并能有效预防肿瘤等多种保健功能^[4]。PC作为一种新型、高效的天然食品添加剂在营养、医药、保健等领域的应用越来越受到人们的关注。本研究拟以PC作为保护剂，探讨其对瘦肉精致雄性小鼠精子质量的影响，为阐明PC保护瘦肉精的生殖损伤提供实验证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级成年雄性昆明（KM）种小鼠50只，入试体重为20±5克，由长沙市天勤生物技术有限公司提供,实验动物合格证书编号：SCXK(湘)2009-0012。所有小鼠均喂养于专属笼，每组一笼，环境温度24℃左右、湿度60%~70%、12小时光照交替的室内饲养，自由摄食、饮水。

主要仪器及试剂

电子分析天平（AB204-N型），METTLER公司；光学显微镜（CK40），日本OLYMPUS公司；超低温冰箱（ SLT-13V-85型），美国HARRIS公司；玻璃匀浆器（20ml）上海博通经贸有限公司；分光光度计（2100型）尤尼柯仪器有限公司。原花青素（P C），纯度＞95%，购于南京泽朗医药科技有限公司；瘦肉精（CL），纯度＞99.9%，购于上海赫澎（上海）生物科技有限公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒，购于南京建成生物工程研究所.

1.3 实验方法

选择50只SPF级成年雄性小鼠按体重随机分为5组（每组10只）：溶剂对照组、CL染毒组、低、中、高剂量PC保护组。CL染毒组按31.5mg/kg.bw剂量灌胃CL溶液；低、中、高剂量PC保护组在灌胃同剂CL的基础上分别按100、200、400（mg/kg·bw）剂量灌胃PC溶液。上述各组灌胃溶液均用蒸馏水作溶剂,灌胃体积为10ml/kg·bw，除对照组灌胃等体积的蒸馏水外，其它每组均上午灌胃CL、下午灌胃PC，每天1次，实验时间均为6周。末次灌胃24h后摘眼球采血，麻醉后处死小鼠,，分离双侧睾丸、附睾，称重计算脏器系数；取新鲜附睾尾制成精子悬液观察精子数量、活动度及形态学的改变；取睾丸实质部分制备组织匀浆液,按试剂盒说明操作分别测定超氧化物歧化酶活性(SOD) 和丙二醛(MDA)的含量。

1.4 统计学分析

实验数据采用SPSS16.0统计软件进行处理，方差齐性时采用单因素方差分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）法；数据用均数±标准差（x±s）表示，以P﹤0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 原花青素对瘦肉精染毒小鼠睾丸附睾脏器系数的影响

表1所示，实验期间瘦肉精染毒组小鼠睾丸、附睾脏器系数均低于对照组（P<0.05）；经不同剂量PC保护后，高剂量PC保护组小鼠睾丸、附睾脏器系数均分别高于瘦肉精染毒组，差别有显著性（P<0.05）。

表1 原花青素对瘦肉精染毒小鼠睾丸附睾脏器系数的影响（ S）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与瘦肉精染毒组比较，P<0.05

2.2原花青素对瘦肉精染毒小鼠精子质量的影响

表2所示，瘦肉精(CL)染毒组小鼠精子数、活动度降低，畸形率增加与溶剂对照组比较，差别有显著性（P<0.05）；经不同剂量原花青素(PC)保护后,中、高剂量PC保护组小鼠精子数、活动度均较CL染毒组增加，畸形率减少（P<0.05），而低PC剂量保护组对其小鼠精子数、活动度升高，畸形率降低影响不明显（P＞0.05）。精子畸形以折体、弯颈、卷尾、不定型、双头、胖头为主。

表2 PC对CL染毒小鼠精子质量的影响（ S）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与瘦肉精染毒组比较，

P<0.05

2.3原花青素对瘦肉精染毒小鼠睾丸组织SOD活性及MDA的含量的影响

表3所示，与对照组比较，CL染毒组小鼠睾丸组织SOD活力明显下降，氧化产物MDA含量升高，差异均有显著性（P<0.05）；经不同剂量PC保护后，高剂量PC保护组小鼠SOD活性较CL染毒组升高、MDA含量减少（P<0.05），而低、中PC剂量保护组对其小鼠SOD活性升高，MDA含量降低的影响不明显，差异均无显著性（P＞0.05）。

表3 PC对CL染毒小鼠睾丸组织SOD活性及MDA的含量的影响（ S）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与瘦肉精染毒组比较，P<0.05

讨论

本实验采用原花青素（PC）干预瘦肉精（CL）致雄性小鼠精子质量损伤的毒性研究，取得了较理想的实验结果。动物脏器系数是亚慢性毒性试验观察较灵敏的指标，能较好地反映化学毒物对该脏器的综合毒性作用。本实验结果显示，瘦肉精致小鼠睾丸和附睾脏器系数下降，加入PC保护后其脏器系数停止下降，并有随其剂量增加而增长的趋势。提示CL和PC对小鼠的性腺脏器具有一定的影响，PC有保护性腺脏器的功能。

雄性动物生殖功能主要体现在它的生精质量，包括产生的精子数量、精子的活力以及其形态的正常。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其它系统还未出现毒性反应之前，生殖系统已出现了损害作用^[5]。因此，检查雄性动物精子的数量、活动力及精子畸形率判断接触化学毒物对生殖细胞潜在的毒性具有较好的针对。本实验结果显示，瘦肉精可以使动物其生精功能质量相应发生改变，出现了精子数量减少,精子的活动度降低，精子畸形率增多；给予PC保护后，中、高剂量PC保护组可提升精子数量和精子的活动度接近正常水平，精子畸形率也相应有所减少。说明PC能够拮抗亚慢性CL染毒所致的生精功能的抑制。

氧化应激是引起生殖细胞凋亡的主要机制之一。生殖细胞的过度凋亡也是导致少精无精的重要机制之一^[6]。所以氧化应激在睾丸毒性损伤中起着不可忽视的重要作用。SOD是一种重要的抗氧化酶，SOD活性与性质的变化成为一个重要的氧化损伤定量指标，而MDA是LPO在体内的最终降解产物,也是氧化损伤的标志物之一，MDA含量的多少可直观地反映机体LPO水平及细胞受损伤程度^[6]。本实验发现瘦肉精（CL）亚慢性染毒可使雄性小鼠的睾丸SOD、活力明显下降，导致细胞内氧化产物MDA含量升高，反映CL已使睾丸抗氧化酶明显下降，脂质过氧化产物大量堆积，将造成生殖腺功能的损伤。说明氨CL致雄性小鼠生殖毒性作用可能与氧化损伤、氧化应激有关。本研究采用PC保护后可明显干预CL所致的氧化应激，SOD、活力明显上升，氧化产物MDA含量下降，提示PC可修复CL的氧化损伤作用。其抗氧化作用是PC修复CL所致雄性生殖损伤的重要机制之一。

综上所述，瘦肉精致实验雄性小鼠生殖毒性作用是肯定的；PC改善CL致生殖损伤的作用也是明确的。本研究初步认为PC对CL致生殖损伤保护机制可能是抗氧化损伤有关。关于PC对CL的保护作用的确切机制尚有待从分子和基因水平上作进一步研究。

参考文献：

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[2] 杨浩峰，严 蕾。盐酸克伦特罗的药理作用危害及检测[J]。地方病通报，2006 ，21（1）：101-102。

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[4] Xu X, Xie H, Wang Y, et al. A-type proanthocyanidins from lychee seeds and their antioxidant and antiviral activities[J]. Journal of agricartur and food chemistry, 2010,58(22):1667-1672.

[5] 费娅丽, 黄小民. 原花青素与细胞凋亡的研究进展[J]. 黑龙江医药, 2009,22(3):352-354.

[6]贾强， 张振玲， 王筱芬。瘦肉精 毒性作用及检测方法研究进展[J] 职业与健康，2005，21（2）：202.

作者简介：陈白莲（1995-），女，大学本科在读，主要从事预防医学专业学习。

通讯作者：邹学敏，女，副教授，E-mail: 865403933@qq.com

基金项目：长沙医学院大学生研究性学习和创新性实验计划项目（编号：2016-117）