曲马多对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞凋亡的影响

曲马多对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞凋亡的影响

张凤爱解军莹彭凤芹

张凤爱解军莹彭凤芹

[摘要]目的了解镇痛药曲马多对体外培养人乳腺癌MCF-7细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，实验组在RPMI-1640培养液中加入不同浓度曲马多（0.01,0.1,1,10,100μmol?L-1），对照组RPMI-1640培养液中不加曲马多，分别孵育48小时后，采用MTT比色法检测乳腺癌细胞增殖活性，采用流式细胞技术检测曲马多对乳腺癌细胞周期的影响，用Hoechst33258染色方法分析鉴定曲马多对乳腺癌细胞凋亡的影响。结果曲马多浓度≥1μmol?L-1时，细胞增殖活性较对照组显著下降（P＜0.05）；随着曲马多浓度增加，G1期细胞比例逐渐增高，S期细胞比例逐渐降低。用Hoechst33258方法染色后在表面荧光显微镜下发现实验组部分乳腺癌细胞发生凋亡，当曲马多浓度≥10μmol?L-1时，荧光显微镜下一个视野内凋亡细胞占总细胞数的比例较对照组显著增加（P＜0.05）。结论曲马多在临床常用剂量范围内对乳腺癌细胞株乳腺癌细胞增殖和凋亡无明显影响，当浓度≥1μmol?L-1时可以抑制人乳腺癌细胞株乳腺癌细胞增殖，主要将细胞周期阻滞在G1期，当曲马多浓度≥10μmol?L-1时可引起乳腺癌细胞凋亡。

[关键词]曲马多细胞增殖细胞凋亡

DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2014.24.050

作者单位：张凤爱，解军莹，261000，山东青州市，青州市人民医院；

彭凤芹，262506，山东青州市，青州市邵庄卫生院。

肿瘤外科手术是实体瘤患者的主要治疗方式。在围手术期，许多因素可能对患者循环中肿瘤细胞产生影响，从而增加肿瘤患者术后转移与复发的几率[1]。镇痛类药物是肿瘤患者围术期镇痛必不可少的药物之一，这类药物同样可能通过各种机制而影响肿瘤细胞的生长、增殖及转移。但迄今为止，镇痛药物对肿瘤细胞生物学行为的影响尚无一致的结论：如Shavit等[2]研究发现，阿片类药物能通过降低机体的细胞免疫反应从而促进肿瘤细胞生长，而更多的学者认为阿片类药物能抑制肿瘤细胞增殖[3]。曲马多是一种非吗啡类强效镇痛药。主要作用于中枢神经系统与疼痛相关的特异受体。由于镇痛作用强、维持时间长而广泛应用于各类手术术中及术后镇痛，但曲马多对肿瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。本研究主要观察不同浓度曲马多对体外培养乳腺癌细胞株乳腺癌细胞增殖活性、细胞周期及细胞凋亡的影响，以了解曲马多用于恶性肿瘤患者围术期镇痛及早中期癌痛治疗的安全性。

1材料与方法

1.1材料RPMI-1640培养基（GiBCo公司），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），PBS（北京天根生物有限公司），胰蛋白酶（中南大学细胞中心），MTT（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司），PI（Sigma公司），双蒸水（中南大学湘雅医院神经内科实验室），无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）曲马多（宜昌人福药业有限责任公司，080903），倒置相差显微镜（德国ZeissAxiovert200），CO2培养箱（THERMO），酶标仪（THERMO）流式细胞仪（美国Coulter公司）人乳腺细胞(中南大学肿瘤研究所实验室提供）。

1.2方法

1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞培养于含10%小牛血清、青霉素（100U?mL-1)、链霉素(100U?mL-1)双抗的RPMI-1640培养基中，在37℃、体积分数为5％CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，定期观察细胞生长情况。每2～3天用0.25%的胰酶消化，进行传代培养。实验所用细胞均处于对数生长期。

1.2.2MTT比色法检测细胞增殖活性细胞以5×104个?mL-1的密度接种于96孔培养板中。实验组和阴性对照组每孔加细胞悬液100μL，空白孔不加细胞，置于CO2培养箱中培养过夜，待细胞已完全贴壁后，小心吸去96孔板内上清液。实验组每孔加入含不同浓度曲马多（0.01,0.1,1,10,100μmol?L-1）的RPMI-1640培养基200μL，阴性对照组与空白调零组只加培养基200μL。每组设六个平行对照孔。孵育48h后，每孔加5mg?mL-1的MTT20μL后继续培养4h，小心吸掉上清液(注意勿将沉淀在下面的紫色颗粒吸掉)，每孔加DMSO150μL，摇床上轻摇10min，至紫色颗粒充分溶解后，用酶联免疫检测仪于570nm测定波长，630nm参照波长下测定每孔的吸光度（OD）值。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期细胞接种于25cm2培养瓶，每瓶细胞数为8×105个，细胞贴壁后，实验组加入不同浓度（0.01,0.1,1,10,100μmol?L-1）的曲马多，同时设定阴性对照组，作用48小时后，收集各处理组乳腺癌细胞，制成单细胞悬液，然后1000rpm离心5分钟，弃上清液。用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。调整细胞浓度为106个细胞/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1mLPI染液（终浓度为PI50μg?mL-1，RNase20μg?mL-1）中，37℃孵育30分钟，采用美国Coulter公司流式分析仪检测细胞周期。

1.2.4Hoechst33258染色方法鉴定细胞凋亡乳腺癌细胞以4×105个/孔接种于96孔板，待细胞已完全贴壁后，小心吸去96孔板内上清液。实验组加入不同浓度(0.01,0.1,1,10,100μmol?L-1)的曲马多，同时设定阴性对照组，作用48小时后，用90%酒精固定细胞以备染色。染色之前用PBS小心清洗3遍，尽量吸去PBS，加入10μg?mL-1的Hoechst1mL，放入37℃培养箱，避光反应15分钟后在荧光显微镜下观测并拍照。

1.3统计学处理所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，利用统计学软件SPSS13.0处理实验数据，采用方差分析或t检验进行统计分析，P＜0.05表示为差异有统计学意义。

2结果

2.1曲马多对乳腺癌细胞增殖活性的影响曲马多浓度≥1μmol?L-1开始，乳腺癌细胞OD值较对照组显著下降（P<0.05）说明曲马多浓度≥1μmol?L-1时，乳腺癌细胞增性明显下降(见图1)。

2.2曲马多对乳腺癌细胞周期的影响随着曲马多浓度增加，G1期细胞比例逐渐增高，S期细胞比例逐渐降低，说明曲马多使乳腺癌细胞阻滞于G1期(见图2)。图3和4为有代表性的阴性对照组和1μmol?L-1曲马多对乳腺癌细胞影响的细胞周期分布图谱。

图１曲马多对乳腺癌细胞增殖活性的影响

Fig1Effectofsufentanilon乳腺癌cellproliferationbyMTTassay

*较对照组比较，P＜0.05.

Fig2Effectofsufentanilonthecellcycleof乳腺癌

*较对照组比较，P＜0.05

2.3曲马多对乳腺癌细胞凋亡的影响用Hoechst33258方法染色后在表面荧光显微镜下观察可见，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核发生核浓缩，可呈分叶状或碎片状致密浓染，呈亮蓝着色（图片中黄色箭头标记），在实验组中随着曲马多浓度增加，凋亡细胞不断增加(见图5)。曲马多浓度≥10μmol?L-1时，荧光显微镜下一个视野内凋亡细胞占总细胞数的比例较对照组显著增加（P＜0.05）（图6）。

图4曲马多对乳腺癌细胞凋亡的影响（Hoechst-PI染色）

Fig5Effectofsufentanilon乳腺癌cellapoptosis

图5曲马多对乳腺癌细胞凋亡的影响

Fig6Effectofsufentanilon乳腺癌cellapoptosis

*较对照组比较，P＜0.05

3讨论

目前临床常用的阿片类镇痛药主要包括吗啡、芬太尼、瑞芬太尼等。近年来许多研究已经证明，吗啡、芬太尼可以抑制肿瘤的生长增殖及转移：如Tegeder等[5]在动物实验中观察到10μmol?L-1以上吗啡能剂量依赖性抑制腺癌细胞增殖；也有关于鼠骨癌模型中芬太尼可抑制肿瘤的生长增殖及转移、吗啡术前与术后给药可以减少肿瘤细胞的播散的研究报道[3-6]

然而曲马多也常用于治疗各种急慢性疼痛，包括术中、术后疼痛治疗。按照Bovill[7]的描述，临床有效靶控曲马多低、中剂量范围为40～80ng?ml-1大剂量为400～600ng?ml-1（相当于1.0～1.6μmol?L-1）本试验通过观察不同浓度曲马多对离体乳腺癌细胞株癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响，发现在临床常用剂量范围内，曲马多对乳腺癌细胞增殖和细胞凋亡没有明显影响，而剂量逐渐加大至1μmol?L-1时可以引起乳腺癌细胞凋亡，增加至10μmol?L-1时可以抑制乳腺癌细胞增殖，主要将细胞阻滞在G1期，使S期细胞减少，这与Tegeder等[5]关于吗啡对肿瘤细胞生物学行为的影响研究结论一致，也是通过阻滞细胞从G1期到S期的进展而实现的。

关于该类药物抑制肿瘤细胞生物学行为的机理主要有以下几种可能：①直接作用于μ受体或生长抑素受体SSTR2：Barg等[8]的实验表明，该药物通过与肿瘤细胞表面的μ受体结合，抑制大鼠神经瘤细胞DNA的合成；对乳腺癌细胞株T47D的体外研究[9]发现，尽管乳腺癌细胞株缺乏μ受体，它可能通过与生长抑素受体SSTR2的相互作用来发挥它对乳腺癌细胞的抗增殖作用；②通过影响细胞因子的表达而保护患者细胞免疫功能，间接发挥对肿瘤细胞生长的抑制：Akural等[10]发现曲马多硬膜外超前镇痛可以减少炎性细胞因子IL-1、IL-6的产生，从而保护患者免疫功能；③诱导肿瘤细胞凋亡：在大多数肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡的抑制发挥着重要的作用，既往许多研究认为：吗啡与芬太尼均可以诱导肿瘤细胞凋亡，其凋亡机理与μ受体没有明显关系，吗啡抑制凋亡的机理主要包括抑制NO和NF-kB的释放[11-12]等，芬太尼则与与改变Bax和Bcl-2的表达有关[13]。曲马多是否通过受体结合抑制肿瘤增殖以及10μmol?L-1以上浓度时引起乳腺癌细胞凋亡的机理有待进一步研究。

综上所述，曲马多在临床常用有效血药浓度范围内对乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖与细胞凋亡没有明显影响，随着浓度不断增加，曲马多浓度依赖性抑制人乳腺癌细胞株乳腺癌细胞增殖，主要将细胞阻滞在G0/G1期，并可引起乳腺癌细胞凋亡，证实曲马多可安全用于恶性肿瘤患者围术期镇痛及癌痛的治疗。

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（收稿日期：2014-03-16）

（本文编辑：刘雪松）