国内耐药肺炎链球菌研究进展

国内耐药肺炎链球菌研究进展

韦秋玲（综述）

韦秋玲（综述）

（广西南宁宾阳县妇幼保健院检验科530400）

【摘要】肺炎链球菌可引起细菌性肺炎、中耳炎和脑膜炎等多种侵袭性疾病，是当今发达国家和发展中国家共有的一个重要病原，WHO估计每年约有160万人因感染此菌而死亡，其中70万～100万为5岁以下儿童。且多数生活在发展中国家。由于抗生素长期的过度使用，许多肺炎链球菌菌株能够同时耐受多种常用抗生素，耐药肺炎链球菌正在朝着“超级细菌”方向发展。面对这一严峻形势，科学家致力于肺炎链球菌耐药性研究及耐药基因的检测以及疫苗的开发，以期寻求理想的解决方法。本文对国内肺炎链球菌的流行现状及其耐药基因相关检测方法和防治策略进行综述。

【关键词】肺炎链球菌药物耐受性基因实验室技术和方法疫苗

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）16-0308-03

ProgressofdrugresistanceofStreptococcuspneumoniaeinChinaWEIQiu-ling,DepartmentofClinicalLaboratory,BinyangWomenandChildrenHealthHospital,Guangxi530400,China

【Abstract】Streptococcuspneumoniaeisanimportantpathogenthatcausesdevastatinginfectiousdiseases,suchasbacterialpneumonia,otitismediaandmeningitisinbothdevelopedanddevelopingcountries.WHOestimatesthateachyearabout1.6millionpeoplehavebeeninfectedwiththebacteriaanddeath,Including700000～1millionforchildrenundertheageoffive.Andmostpeopleindevelopingcountries.Duetotheexcessiveuseofantibiotics,theresistanceofpneumococcalisolatestomanyofmanyofthecommonlyusedantibioticsresultsinfewereffectiveantibioticsavailablefortreatment.AstheresistantS.pneumoniaeisgraduallyapproachingwhatthe“superbug”is,tFacingtheserioussituation,Scientistsstreptococcuspneumoniaeresistancetoresearchanddrugresistancegenedetectionandvaccinedevelopment,soastoseektheidealsolution.ThisarticleprovidesanoverviewofthecurrentstatusofdrugresistanceofS.pneumoniaeandResistancegenesrelateddetectionmethodsandcontrolstrategyissummarizedinthispaper.inChina.

【Keywords】Streptococcuspneumoniedrugtolerancegenelaboratorytechnologyandmethodsvaccinne

肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,SP）可从呼吸道或血流入侵，引起中耳炎、鼻窦炎和肺炎，严重时导致败血症和脑膜炎。是人类感染性疾病的重要病原，易感者多为儿童和老年人。我国多名医学工作者在对每年数百万例社区获得性肺炎进行连续几年的病原学相关性研究发现肺炎链球菌与流感嗜血杆菌同是社区获得性肺炎的主要病原之一，由于抗生素长期过度使用，近年来耐药肺炎链球菌导致的感染增多，使得临床可应用的有效抗生素越来越少，不但影响临床病原学检测，同时导致细菌耐药率不断增加，给临床治疗带来困难[1]。

本文就国内肺炎链球菌耐药性的流行概况、耐药基因检测、疫苗的开发等方面进行综述。

1国内肺炎链球菌耐药性的流行概况

肺炎链球菌曾经对青霉素普遍敏感。自1967年报道首例耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）以来，耐药肺炎链球菌不断被检出。至20世纪80年代中期，PRSP已在全球广泛报道，在多个国家发生率已超过10%[2]。我国大陆地区对肺炎链球菌耐药性的监测起步较晚，先是在上海、北京、成都、广州几个城市的个别医院开展，当时的监测数据[3]显示，PRSP明显低于欧美国家的报道，但对大环内酯类（红霉素、阿奇霉素、克拉霉素）和克林霉素耐药率相当高，达到60～80%，高于欧美，与韩国、日本相似。20世纪90年代后期以来，我国开始广泛应用青霉素口服制剂，PRSP检出率迅速上升，1997年在第20届国际化疗会议上，中国大陆以45%的耐药率在全球排名第12位[4]。北京分离的菌株中，1983-1985，青霉素不敏感肺炎链球菌（penicillin-nonsusceptibleStreptococcuspneumoniae,PNSP）的检出率为6%，均为中介水平，1999-1997年增加至21%[5],2002-2005年为21%-32%[6];2006年达到76.2%，其中47.6%为耐药[7],2005-2006年，8个城市9家医院参与的一项研究（以下称八地监测）发现[8]青霉素耐药率达64.3%，中介率为17.6%，2006-2008年在北京、天津上海、广州和深圳5家儿童医院开展的住院肺炎流行病学研究（以下简称五地监测）发现青霉素中介/耐药率为65.2%/22.2%。2008年美国临床实验室标准化协会（CLSI）对青霉素的折点进行了修改，这次修改使得我国呼吸道分离的肺炎链球菌对青霉素的不敏感率大幅度降低，单从流行病学监测的耐药率来看，肺炎链球菌青霉素耐药状况似乎不再是那么严重，但有学者[9]指出事实并非如此，理由是：首先，动态观察到的肺炎链球菌耐药增多、耐药性增强的趋势令人担忧，其次国内长期使用青霉素剂量偏大，当前又普遍使用头孢菌素类抗生素，使用新标准时非脑膜炎肺炎链球菌对多种头孢菌素的耐药率远远高于青霉素，这一点也给临床实践带来了困惑。再者新标准中脑膜炎分离株的耐药界值较以往低，没有中介，只有敏感和耐药2个界值。近期几项研究采用了2008年CLSI的判定标准，结果提示肺炎链球菌的耐药问题依然严峻。2009年12家教学医院222株非脑脊液分离株的抗生素敏感性为青霉素中介率/耐药率为0.5%/21.6%[10]。

在大环内酯类抗生素于上世纪80年代后期大量投入临床使用后，耐大环内酯类抗生素的肺炎链球菌也以惊人速度上升，以北京儿童医院的连续性监测数据为例，1983-1985年红霉素的耐药率仅为2%，1995-1997年达到79%[4]，2006年达到100%[7]，五地监测的结果也显示肺炎链球菌对红霉素等大环内酯类抗生素的高耐药率为99.7%，八地监测结果显示为95.1%。

肺炎链球菌通常对万古霉素和氧氟沙星敏感率高，八地监测菌株对万古霉素、左旋氧氟沙星和莫西沙星几乎100%敏感。目前，氯霉素、四环素和复方磺胺甲恶唑在临床应用已很少。氯霉素耐药率虽然低于20世纪80年代数据（53%）[4]，但仍在20%左右。四环素和复方磺胺甲恶唑的耐药率长期保持在85%以上，并没有明显的下降倾向，专家推测这可能与动物使用抗生素和多重耐药菌株流行有关[9]。

国内分离的耐药肺炎链球菌常常表现为多重耐药（对3种或3种以上抗生素耐药），不同地区监测的多重耐药率有些差异（43.2%[10]～90.0%[8]，除与研究的宿主、监测地区等不同有关外，亦与研究中检测抗生素的种类有关，尤其对青霉素和（或）红霉素耐药的菌株，多重耐药率高[11].尽管当前肺炎链球菌尚对万古霉素及氧氟沙星等普遍敏感，但就其耐药性发展的情况看，如果抗生素选择压力持续存在，它完全具备发展成为“超级细菌”的潜力。

2肺炎链球菌的耐药基因的检测

细菌对抗生素的耐药性可分为固有耐药性和获得性耐药性。如果细菌缺失了抗生素作用的靶位基因，那么这种耐药性就是细菌所固有的；而如果细菌染色体发生基因序列改变，又或细菌获得外源性抗生素耐药基因之后，那么细菌产生的耐药性则是获得性的。肺炎链球菌耐药性的快速发展和扩散可能是由于细菌获得了携带有耐药基因的基因片段。传统的琼脂纸片扩散法、稀释法、浓度梯度法常用于检测肺炎链球菌的耐药表型。而近年来利用分子生物学检测肺炎链球菌的耐药基因，可更快捷更有效地为临床早期诊断提供可靠的依据。目前较成熟的分子生物学的检测方法有以下几种:

2.1盒式聚合酶链反应（BOX-PCR）肺炎链球菌基因中散布着高度保守的重复的DNA序列，成为BOX元件，肺炎链球菌基因中最多包含25个BOX元件。随着此元件的三个亚基：A、B、C的组合不同，组合后的碱基数不同，因此，使用BOXA序列为引物，可以产生不同大小的DNA扩增产物，由于肺炎链球菌可以产生不同数量和不同大小的DNA扩增产物，据此可以追踪肺炎链球菌的同源性。林淑珍等应用BOX-PCR对武汉2001～2002年84例青霉素中介值肺炎链球菌（PISP）进行检测,结果显示,PISP的发生率为41.6%，同时耐四环素、红霉素的占91.4%，同时耐7种抗菌药物的占65.7%[12]。

2.2青霉素结合蛋白基因DNA指纹（DNAfingerprintingofthepenicillin–bindingproteingenes）将肺炎链球菌经PBP1a、2b、2x基因进行聚合酶链反应扩增，内切酶消化后进行图谱分析，结合多位点酶电泳、血清分型进行图谱分析检测PBP基因的水平转移。肺炎链球菌的耐药与水平传播有关，PBP等位基因可以稳定遗传并成为其他肺炎链球菌b-内酰胺类抗生素水平转移的耐药基因。朱芹等通过青霉素结合蛋白基因DNA指纹技术并结合BOX-PCR,阐明了杭州地区高PRSP耐药性的发生与传播机制[13]。

2.3PCR法根据肺炎链球菌自溶素和溶血素的基因序列，设计两对寡核苷酸引物YH1扩增自溶素基因中的354bp的DNA片段，YH7扩增自溶素基因中的307bp的DNA片段。，再裂解提取被测菌的DNA,在一定条件下进行扩增，经琼脂糖电泳后检测特异区带。吴文娟等人用PCR扩增耐药基因ermB、mefA、mefE、msrD及Tn1545-Tn916家族转座子整合酶基因intTn，结果188株红霉素耐药株中耐药基因ermB总检出率为91.5%，mefE总检出率为38.3%，未检出mefA基因。97.7%的红霉素耐药株中存在转座子整合酶intTn[14]。

2.4DNA探针杂交法肺炎链球菌编码自溶素的lyt基因是其特异基因，可作为分子检测标志，采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌特异的1段263bp的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针，并用生物素标记的DNA探针，通过斑点杂交法快速检测出肺炎链球菌。所合成的探针具有高度特异性，与其他细菌间无交叉反应，该方法能检测出10ng细菌的DNA。樊慧珍等在50份痰标本中检出肺炎链球菌培养阳性者8份，杂交阳性者12份，PCR阳性者18份。反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点，对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义[15]。

3多重耐药肺炎链球菌的防治策略

3.1审慎地选择和使用具有最佳抗菌活性的抗菌药物在减少耐药性肺炎链球菌流行上具有重要意义，根据药效学和药动学资料，我们可较为合理地选择抗菌药。

药动学是研究药物在机体内的吸收、分布、代谢和清除。药效学是研究药物浓度和药物在活性部位的预期药效之间的关系。由于细菌对某一药物的MIC值仅能部分反映其效能，作为抗菌药物选择的唯一标准将会产生误导作用。β-内酰胺类抗生素、大环内酯类和克林霉素的杀菌率与血药浓度超过MIC值的时间长度有关；氨基糖苷类和喹诺酮类的杀菌率与血清浓度正相关。Azalide、阿奇霉素、酮内酯、四环素、万古霉素和链阳霉素则显示时间依赖的杀菌率，且有一个延长的后抗生素效应，尽管药效学和药动学尚属于理论阶段，但对这些参数的理解将帮助临床医生选择合适的抗菌药物并设计合理的剂量方案，在面临增长的抗生素耐药性和选择有效的经验治疗药物的要求下，该方法显得尤为重要。

除此之外，尽可能定期获得当地或区域性监测数据可帮助决定最合适的治疗方案。这些资料可与社区获得性肺炎球菌肺炎、急性中耳炎、急性细菌性鼻窦炎和肺炎球菌脑膜炎等的治疗指南相结合使用。

3.2美国免疫实施顾问委员会推荐使用肺炎链球菌血清型23的纯化荚膜多糖疫苗免疫风险人群。近几年，开发出一种包含血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的7价结合疫苗专门应用于该人群。对37868名健康婴儿的随机双盲试验表明，接受至少1次疫苗接种的儿童中，侵袭性肺炎链球菌感染的发生率减少了89.1%.该疫苗还减少了8.9%的中耳炎。另外一项肺炎链球菌7价疫苗的研究（n=1662）中，疫苗接种者中耳炎的发生率减少了57%。因此，有希望通过在儿童中广泛使用该疫苗来减少肺炎链球菌引起的侵袭性感染和中耳炎，而且可减低耐药性肺炎链球菌感染的发生[16]。

由于对青霉素和其他种类的多重耐药，肺炎链球菌已成为遍布全球的难以对付的病原菌。必须合理、审慎使用抗生素以减少选择性压力，从而控制耐药株的播散。结合药敏试验结果和药效学及药动学资料，根据当地监测数据来制定合适的经验用药选择方案将有助于控制肺炎链球菌耐药的进一步发展。在全球范围内肺炎链球菌对抗生素的耐药性变化并不完全是一件坏事，Low[17]最新研究表明在一些地区通过使用疫苗和合理使用抗生素正在降低肺炎链球菌对一些抗生素的耐药性。

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