TSP-1在唾液腺腺样囊性癌中的表达及意义

TSP-1在唾液腺腺样囊性癌中的表达及意义

龚仁国1王晓毅2宣鸣2

龚仁国1王晓毅2宣鸣2

（1攀枝花学院附属医院口腔科四川攀枝花617000)

(2四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科教研室四川成都610041）

【中图分类号】R730.4【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2010）08-025-03

【摘要】TSP-1蛋白在唾液腺腺样囊性癌中表达增高，提示它可能在肿瘤的发生和发展中具有一定的作用。

【关键词】TSP-1蛋白腺样囊性癌免疫组织化学

血小板反应蛋白－1（TSP-1）是血管生成最重要的调节因子之一,血管生成促进因子和抑制因子之间形成动态平衡，当这一平衡倾向于血管生成促进因子时，则新生血管形成;倾向于血管生成抑制因子时，则不发生新生血管形成，肿瘤趋向于局限和稳定。

腺样囊性癌(ACC)，浸润性极强，易局部复发；易沿神经扩散；易血行性转移，转移率高达40％。本实验采用免疫组织化学方法研究TSP-1在ACC中的表达水平，并分析其与临床病理指标之间的关系，以探讨TSP-1在ACC发生发展中的作用及意义。

1材料与方法

1.1组织标本

收集四川大学华西口腔医院1998—2003年间ACC石蜡标本45例，男20例,女25例；年龄27-70岁，中位年龄47岁。10例正常唾液腺组织，其中腮腺6例，来自经组织病理学证实无颈部淋巴转移的颈清扫腮腺下极，并经病理证实为正常的腮腺组织；舌下腺4例，取自舌下腺囊肿患者的舌下腺，经病理证实为正常舌下腺。

1.2试剂

浓缩型鼠抗人TSP-1单克隆抗体（购自福州迈新生物技术有限公司，Neomarkers公司产品），工作浓度为1：100；链酶菌抗生物素蛋白－过氧化物酶复合物（S－P）试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3实验方法

采用免疫组织化学S-P法，主要步骤如下：石蜡包埋组织切片常规脱蜡水化后，蒸馏水漂洗5min。3％的H2O2室温下孵育30分钟以阻断内源性过氧化物酶活性；沸水中枸橼酸缓冲液预热后，热修复组织抗原20min；自然冷却，蒸馏水冲洗3次，每次5min；滴加一抗（TSP-1抗体），4℃冰箱中过夜；恢复室温，PBS冲洗3次，每次5min；滴加二抗，37℃烘箱孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5min；加新鲜配制的DAB溶液显色；自来水冲洗，苏木精复染，中性树脂封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已证实TSP-1阳性的人脐带组织切片为阳性对照。

1.4结果判定

光镜下随机观察5个400倍视野，以细胞浆呈棕黄色或棕色为阳性，计数不少于500个细胞中进行细胞计数及评分，根据染色程度及染色细胞百分率进行分析评分。参照Schindl和Neufeld等的方法记分：A项:按有无着色及着色强度(以多数阳性细胞呈现的染色为准)计分:不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;B项:按阳性细胞百分率，1%～10%为1分，11%～50%为2分，>51％为3分。计算每张切片的染色积分=A×B,以得分0～2分为阴性（-），3～4分为弱阳性（+），5～7分为中度阳性（++），8～9分为强阳性（+++）表达。

染色结果判定：由两名病理科医师盲法独立阅片完成，同时通过HE染色切片观察，证实所有标本为腺样囊性癌或正常腺体组织。

1.5统计学处理

应用SPSS13.0软件进行统计学分析。对各组TSP-1阳性表达率进行x2检验，检验水准为α＝0.05。

2结果

2.1TSP-1蛋白在正常唾液腺及ACC中的表达

TSP-1蛋白免疫组化染色阳性产物呈棕黄色或棕色，主要分布于细胞浆内。ACC中TSP-1表达高于正常唾液腺，两者之间差异具有统计学意义。（见图1～2，表1)。

图1TSP-1在正常唾液腺表达较低(×200)

图2TSP-1在ACC腺样型中高表达(×200)

2.2TSP-1蛋白表达与临床病理指标的关系

本研究中TSP-1的表达与临床分期及转移有关（见表2）。

3讨论

腺样囊性癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一。该瘤侵袭性强，手术切除不易彻底，复发率高，而且极容易侵入血管，造成高的血行转移率。

TSP-1主要存在于血小板α颗粒中，在许多正常细胞及肿瘤细胞中均有广泛的表达。TSP-1作为一种重要的细胞外基质糖蛋白通过与其相应的细胞表面受体结合，激活多种信号传导途径从而发挥多种生物学功能。

TSP-l由Baenziger等首次从凝血酶刺激后的血小板细胞膜中分离。1986年，Lawler和Hynes克隆出了TSP-1的cDNA编码序列。它的编码基因位于15q15，全长约16kb，含22个外显子，读码框约5.8kb，在启动子区域包含多个转录因子的结合位点，TSP-1蛋白由3条相同肽链组成同源三聚体，分子量约145kDa，每个亚单位由1152个氨基酸残基组成富含半胱氨酸的多肽。在透射显微镜下，该三聚体的每个亚单位都形成球状氨基末端，球状羧基末端，中间以细长杆状臂连接的结构。

新生血管生成在实体肿瘤生长、浸润和转移中起着重要作用，而血管生成因子在新生血管生成的调控中又起着重要作用。TSP-1在多种肿瘤的生长、转移及血管生成过程中起重要的调节作用。但目前TSP-1是肿瘤新生血管生成的抑制因子还是促进因子尚存在争议。有报道称TSP-1可以促进细胞的粘附、增殖、血管新生及肿瘤生长。TSP-1可与细胞表面受体及其它大分子物质如胶原等相互作用,介导一系列复杂的细胞功能。许多种细胞包括上皮细胞、间质细胞和肿瘤细胞均能分泌TSP-1到细胞外基质中。1987年首次发现TSP-1是一种肿瘤细胞及血小板的粘附蛋白，但TSP-1促进肿瘤细胞迁移和浸润的确切机制尚不清楚,已有证据表明TSP-1作为一种基质蛋白与血管基底膜密切相关,可调节血管生成,同时实体瘤基质中高表达的TSP-1有很强的促结缔组织增生的能力。同时也有一些报道与此相反，TSP-1可以降低细胞的粘附，诱导凋亡，抑制血管新生，抑制肿瘤生长。这些不一致的说法可以归因为TSP-1作用于不同的细胞型上不同的受体从而引发出不同的生物学效应。TSP-1复杂的分子结构决定了其受体的多样性。TSP-1还可调节一些蛋白酶及生长因子的功能。以上这些发现提示,TSP-1在肿瘤血管生成中的作用可能依赖于肿瘤的类型和内环境模式,但是在许多学者的研究中显示TSP-1在肿瘤血管中的作用呈现浓度依赖性。

Tuszynski等报道，在给小鼠接种肉瘤细胞之前5分钟预先注射纯化TSP-1，可加强实验性肺转移的形成。将表达反义TSP-1的载体转染至人鳞癌细胞使其TSP-1表达下降，该细胞在小鼠腹腔内的生长率及成瘤能力均有所下降。此外，提高TSP-1的表达水平可使NIH3T3细胞获得非血清、非锚定依赖性体外培养的生长转化表型。Albo等发现，TSP-1通过上调尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)从而促进培养胰腺癌和乳腺癌细胞的侵袭性。对胆囊癌和食管鳞癌的临床研究发现:多数恶性程度高的肿瘤可见TSP-1表达而低度恶性者则未见，而且TSP-1表达阳性的病例淋巴转移及静脉累及更为常见。上述这些研究均支持TSP-1促进肿瘤恶性进展的观点。

在本研究中，45例ACC中TSP-1染色大多数分布于肿瘤细胞的胞质中,有少部分分布于细胞外基质,这与文献报道相一致。TSP-1在唾液腺ACC组织中的阳性表达率为57.8％（26/45），明显高于其在正常唾液腺(10%,1/10)中的表达(P<0.05)，这提示TSP-1在SACC的发生、发展及血管生成过程中具有重要的调控作用。TSP-1在Ⅲ、Ⅳ期（73.7％，14/19）的ACC中的表达比Ⅰ、Ⅱ期（46.2％，12/26）高（P<0.05），在有转移的ACC组织（85.7％，12/14）中的表达也高于无转移者（45.2％，14/31）（P<0.05），提示TSP-1蛋白在ACC的浸润、转移过程中起到了促进作用，提示TSP-1可成为ACC病情检测与诊断的一个生物学指标。

参考文献

[1]CrrossfeldGD,CrinsbergDA,SteinJP,etal.Thrombospondin-1expressioninbladdercancer：associationwithp53alterations,tumorangiogenesis,andtumorprogression.JNatlcancerlnst,1997,89(3):219-227.

[2]邱尉六.口腔颌面外科学，5版.北京：人民卫生出版社，2003：301.