纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析

纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析

刘海珠杨燕徐建利

刘海珠杨燕徐建利(山东省威海市立医院264200)

【中图分类号】R978.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）12-0154-02

【关键词】抗菌药物敏感试验方法

抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。

1实验材料

抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4mm)。使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。

2实验方法

2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。盖上表面皿盖，置室温放置3～5min，使平皿表面稍干。

2.2贴放药物纸片：用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片平整地贴于平板表面，稍加按压使纸片贴紧。注意纸片分布均匀，各纸片中心相距24mm以上，纸片距平板内缘应大于15mm。纸片贴牢后切勿移动，否则会影响抑菌圈的形状。

2.3培养：贴好纸片后，须于15min内将平板置于35℃培养箱中，孵育至规定时间(一般为18～24h)。为使平板温度均匀，最好单独摆放，叠放不超过2个。

3结果判断

用游标卡尺或米尺从平板背面测量抑菌圈直径(mm)。如果培养基中加有血液，可打开表面皿盖，从正面测量抑菌圈。抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌生长为限。

针对抑菌圈直径测量值报告敏感、中介或耐药：①敏感(S)，表示待测菌能被常规剂量的测定药物在体内所达到的药物浓度抑制或灭杀；②中介(I)，表示待测菌对常规剂量的测定药物反应性低于敏感株，但在该药物生理浓集部位(如尿液、胆汁)具有临床效力或者可以通过加大药物的剂量进行治疗，它表示抑菌环直径介于敏感与耐药之间的“缓冲区”，可以避免微小的不能控制的技术因素造成的结果解释错误[2]；③耐药(R)，表示常规剂量的测定药物在体内所达到的药物浓度不能抑制待测菌生长[2]。

4质量控制

质量控制是采用与常规试验相同的操作方法，测定质控菌株(标准菌株)的抑菌圈。常用的质控菌株有金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞杆菌ATCC27853等。质控菌株的抑菌圈应在允许范围内，这个范围为95％的可信区间，即实验室日间质控得出的连续20个试验结果中，仅允许有1个结果超出这个范围。如果经常有质控结果超出这个范围，说明试验方法不稳定。每日质控菌株的抑菌圈直径的均值应接近允许范围的中间值，否则说明操作中有不规范之处，应查找原因并及时纠正。原则上应每天进行质量控制，但在试验条件恒定的情况下，可每周做2次以保证质量检测。如果发现失控，立即改为每日监测[3]。

5影响因素

5.1抗菌药物纸片：纸片含药量是影响抑菌圈大小的重要因素，而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径、保存方式等有关。批量制备的抗菌药物纸片，每张纸片所含的药物浓度必须相同；纸片保存条件应以低温干燥为佳，如保存不当可使药物效力降低，致使抑菌圈缩小。

5.2培养基与接种菌量：培养基pH值改变，碱性可扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈，酸性可扩大四环素族药物的抑菌圈；琼脂过厚、过硬会影响药物渗透，造成抑菌圈缩小[3]；接种菌量加大可使抑菌圈减小，反之可使抑菌圈扩大。

5.3操作因素：菌液涂布应厚薄均匀；接种细菌后，平板应在室温放置片刻，待菌液被培养基吸收后再贴纸片；孵育温度、孵育时间应严格遵循要求；平板堆放不超过2块，以使其受热均匀；测量抑菌圈应仔细、准确。此外，要注意质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。

参考文献

[1]王传新,王国礼.现代检验医学技术及质量控制[M].济南:山东科学技术出版社,2004:171.[3].

[2]董亮,吴大玮,孙思华,等.临床疗效及药敏试验研究[J].中国全科医学,2004,7(7):451.

[3]杨文杰,陶家驹,张宾,等.大型综合医院524株细菌的分离鉴定及其耐药性分析[J].中国全科医学,2001,4(10):781-783.