凝胶层析法测定蛋白含量方法研究

凝胶层析法测定蛋白含量方法研究

刘国辉

哈尔滨市哈药集团生物工程有限公司150025

【摘要】目的分析凝胶层析法对蛋白含量的测定过程和测定效果。方法将蛋白浓度以及蛋白出峰面积，分别作为坐标系的横、纵坐标轴，绘制BSA浓度标准曲线。并以BCA试剂盒法作为参照，对凝胶层析法在蛋白含量测定效果做出评价。结果BCA法与凝胶层析法的相对误差，分别处在7.3%到121.2%，以及0.85%到42.31%之间。凝胶层析法的测定精准度，高于BCA法。结论凝胶层析法，在蛋白含量的测量上，具有测定方法简单、操作便捷、测量精准度高等优点。建议广泛采用。

【关键词】蛋白含量；凝胶层析法；方法研究

【中图分类号】R977.1+3【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-12-023-02

在医学以及生物化学等学科中，蛋白质含量的测量准确度，具有十分重要的意义。当前常采用的方法，主要有紫外吸收法、双缩脲法、凯氏定氮法等[1]。然而上述方法大都需要昂贵的仪器设备，以及繁琐的操作步骤，加之实验过程中会产生各种化学毒素，对实验者也会造成一定危害[2]。所以无法广泛采用。本次研究，则针对凝胶层析法的测定效果进行分析，并获得较为理想的测定精准度。现报告如下。

1.资料与方法

1.1材料与仪器

材料选择2mg/mL牛血清白蛋白（BSA），采用AKTAPrimePlus蛋白纯化系统，并以UV-2600（PC）扫描型双光束紫外可见分光光度计检测。层析色谱：在室温下，以1.0mL/min的流速，选择超纯水作为流动相，以215nm进行检测。

取10mL离心管共16支，分别以A-H与1-8进行数字编号。采用不同配比，对牛血清白蛋白进行稀释。其配比方法，见表1。

去蛋白检测试剂盒（BCA），将1mL的B工作剂与50mL的A工作剂进行混合。

1.2方法

1.2.1标准曲线

于37℃水浴下，加入2mL工作液。并在1-8以及A-H号配比中，分别取出0.1mL的溶液，将其滴入5mL试管内。以562nm可见光照射，对比观察1-8以及A-H溶液的光吸收度，并将前者浓度，作为纵坐标，后者作为横坐标。对其进行回归分析。并采用1-7号溶液，对回归曲线，进行准确性检验。

1.2.2测定方法

将1-7与A-H号溶液，使用进样器送入蛋白纯化系统。而后对各不同浓度下，BSA的峰面积进行测定。此一过程，采用A-H号为横坐标，纵坐标则为峰面积，同样以1-7号溶液，对回归曲线，进行准确性检验。

2.结果和讨论

2.1BCA标准曲线

BCA标准曲线，如图1所示。根据曲线可知，R²值应为0.985，且y=1.012x+0.0705。结合1-7号浓度溶液，所表现出的不同吸光度，可对其理论浓度进行计算。并对准确度进行检验。其具体结果，可见表2。

2.2凝胶层析法BSA标准曲线

曲线绘制结果见图2，根据曲线图可知，R²值为0.981，且y=1379.2x+78.36。1-7号溶液的理论浓度，可采用BSA峰面积进行计算。并且对回归曲线，进行准确度检验。其检验结果，可见表3。

采用BCA法以及凝胶层析法，对BSA溶液进行测定，其相对误差，在表2与表3中有所体现。结果显示，BCA的相对误差范围较大，处在7.3%到121.2%之间。其测量准确度较差。而凝胶层析法，的相对误差范围，处在42.31%以下，误差相比较小，测量精准度较高。

3.结论

凝胶层析法，是一种采用具有网眼的凝胶衍生物进行检测的方法。在测定过程中，可充分发挥孔径分布特点，根据分子大小不同，将物质分子分离。由于蛋白中较大分子一般以正态分布，所以层析过程中会最先流出，最终形成蛋白峰[3-4]。而在蛋白纯化系统中，可根据蛋白溶液进样，对蛋白浓度进行计算。

由本次实验过程可知，凝胶层析法具有较高的检测精准度，同时测定过程简单，操作容易，获得结果时间较短，所用设备、仪器造价较低。因此，在一些基础设施配置薄弱、测定条件较差的领域和机构，采用凝胶层析法是不二选择。

参考文献：

[1]王霞，刘金玲，高硕.聚乙二醇沉淀法与凝胶色谱层析法检测巨泌乳素的相关性研究[J].检验医学，2013，28（9）：824-827.

[2]孙浩思，王莉娜，林智平，等.高效凝胶过滤色谱法测定啤酒中混浊活性蛋白质的研究及应用[J].啤酒科技，2015，6（12）：22-30.

[3]李晶，苑方园，程速远，等.PEG化重组尿酸氧化酶蛋白含量测定方法研究[J].生物技术通讯，2014，21（4）：542-546.

[4]张俊，吕小东，于伟，等.水解珠蛋白粉中寡肽含量及分子量分布的测定方法研究[J].饲料与畜牧：新饲料，2013，12（5）：53-55.