HPLC法测定芦根枇杷叶颗粒中橙皮苷的含量

HPLC法测定芦根枇杷叶颗粒中橙皮苷的含量

杜国成

杜国成（江苏省扬州市中医院225000）

【摘要】目的：建立芦根枇杷叶颗粒中橙皮苷的含量测定方法。方法：采用HPLC法，C18柱，以甲醇－醋酸－水（23：4：73）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为283nm。结果：橙皮苷在40.16μg/ml～321.28μg/ml范围内线性良好，r＝1.0000，平均回收率为98.3％，RSD为0.5％。结论：此法准确、快速、精密度好，可作为该产品的主要质量控制方法。

【关键词】芦根枇杷叶颗粒橙皮苷高效液相色谱法

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）32-0160-03

1.前言

芦根枇杷叶颗粒具有润肺化痰、止咳定喘等功效，对伤风感冒、支气管炎有较好的治疗效果。原本为《江西省药品标准》中的复方枇杷叶冲剂，后经对制备工艺等的优选、改进及提高，上升为国家药品标准，[1]现收载于《国家中成药地方标准上升国家标准内科肺系（二）》中。[2]该制剂系由枇杷叶、干芦根、紫菀、桔梗、陈皮、盐酸麻黄碱、杏仁水、甘草流浸膏、蔗糖和糊精等原料结合传统制备工艺制得，如今已有多家中药制剂企业都开始生产该中成药。

目前，芦根枇杷叶颗粒并未收载于药典中，测定标准只是按2005版药典的薄层作检查，含量测定只有一项以盐酸麻黄碱作为指标，而其他处方组成的药味并无定量指标。而今，随着现代分析技术突飞猛进地发展和对中药系统研究的不断深入，其他含紫菀、陈皮、甘草流浸膏等成分的中成药，已经有很多都已经制定了更为严谨的相应的质量标准。

陈皮是芸香科植物橘（CitrusreticulataBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，为作为该制剂的君药之一，且活性成分明确，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，[3]目前主要以其中所含的主要有效成分之一的黄酮类成分橙皮苷作为检测指标性成分。

橙皮苷的常用检测方法为紫外分光光度法[4]，但该方法专属性较差。高效液相色谱法（HPLC）是目前对中药无论是单味药还是成方制剂进行含量测定应用最为广泛的一种方法。该方法不仅检测精确，用量少，而且快速。许多中成药都已经制定出HPLC指纹图谱，而中成药中的单一组分应用高效液相色谱法测定在2005版药典中已经广为应用了。于是人们转向于尝试利用高效液相色谱测定各种药材及制剂中橙皮苷的含量[5-7]，如邓茂芳[5]等采用高效液相色谱法测定四制香附丸中橙皮苷的含量。

为了更好地控制芦根枇杷叶颗粒的质量，研究建立了HPLC法测定该制剂中橙皮苷的含量，该方法简便、准确、重现性好，在控制该药质量上获得较为满意的效果。

2.实验研究

2.1仪器与试药

2.1.1仪器高效液相色谱仪：waterse-2695(包括：四元泵、自动进样器、在线脱气装置、柱温箱、2996DAD检测器），Empower色谱工作站；十万分之一电子天平（Sartoriuscp225D）；色谱柱：WatersODSC18（150mm*4.6mm，5μm）。

2.1.2试药橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110721－200512，供含量测定用）。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。芦根枇杷叶颗粒（批号：080612、080715、090201）由扬州沪港新亚药业有限公司提供。留样凭证存放于扬州市药品检验所。

2.2方法与结果

2.2.1色谱条件及系统适应性

色谱柱为WatersODSC18（150mm*4.6mm，5μm）；流动相：甲醇－醋酸－水（23：4：73）；检测波长283nm，流速1.0ml/min，柱温25℃。进样量10μL。在此条件下，橙皮苷得到良好的分离，理论塔板数按橙皮苷计算应不低于2000。色谱图见图1。

色谱柱理论板数：在选定的条件下注入混合标准品液，按n＝5.54(tR/Ｗh/2)2分别计算色谱柱理论板数n。tR为保留时间，Ｗh/2为半峰高宽。（系统适用性试验结果：需要保留时间和理论塔板数）

图1对照品、样品及阴性对照品高效液相色谱图

2.2.2测定波长的选择

取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成对照品溶液,置紫外分光光度计记录其紫外吸收光谱,结果显示,橙皮苷在283nm波长处有最大吸收,故选择283nm为测定波长。

2.2.3对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品10.04mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别量取对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。依次制成浓度梯度为40.16、80.32、160.64、240.96、321.28μg/ml。

2.2.4供试品溶液的制备

取本品适量，研细，精密称取10g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量（准确至0.01），超声处理（功率2500W，频率20KHz），30分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，微孔滤膜（0.45μm）滤过，作为供试品溶液。

2.2.5线性关系考察

按浓度梯度分别取各对照品稀释液进样各10μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，橙皮苷含量（单位：μg/ml）为横坐标，数据见表1，绘制标准曲线，得到橙皮苷的回归方程为y＝18854x－8389.5，R2=0.9987。实验结果表明：橙皮苷在40.16μg/ml～321.28μg/ml范围内有良好的线性关系。

表1标准曲线绘制数据

浓度(μg/ml)峰面积

40.16748130

80.321503826

160.643027449

240.964529453

321.286050202

图2橙皮苷对照品溶液的标准曲线

2.2.6精密度试验

精密吸取标曲项下4.0ml对照品液，进样，连续进样6次，每次10μL，橙皮苷峰峰面积的RSD为0.37％。表明仪器精密度良好。色谱峰结果见表2。

表2色谱峰结果

结果ID保留时间（min）面积平均峰面积峰面积RSD%

1140830.035302181330265260.37

2140930.0423033086

3141030.0393038825

4141430.0773019738

5141830.1063009788

6142230.1063035903

2.2.7稳定性试验

取批号为080612的供试品溶液，照“2.2.4”项下的方法配制成供试品溶液后分别在0h、1h、2h、4h、8h进样5次，橙皮苷平均峰面积的RSD为1.1％，表明样品溶液在8h内稳定。结果见表3。

表3稳定性试验色谱峰结果

结果ID样品名称保留时间（min）面积平均峰面积峰面积RSD%

11441样230.035313899530265260.371

21442样230.0453196953

31484样230.0353110707

41485样230.0453142112

51486样230.0353121057

2.2.8重复性试验

取批号为080612的样品5份，照“2.2.4”项下的方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果见表4。橙皮苷的含量分别为0.426mg/g、0.415mg/g、0.425mg/g、0.420mg/g、0.424mg/g，平均含量为0.422mg/g，RSD为1.1％，表明本方法重现性良好。

表4色谱峰结果

结果ID样品名称保留时间（min）峰面积平均峰面积峰面积RSD%

11440样130.025340623634047830.06

21468样130.0253403329

31441样230.035313899531679741.29

41442样230.0453196953

51443样330.048336690133391801.17

61444样330.0583311459

71445样430.087321735932212480.17

81446样430.0423225136

91447样530.000327229432514780.91

101448样530.0213230662

2.2.9加样回收试验

精密称取已知含量的样品（批号080612），共5份，分别精密加入一定量的橙皮苷对照品，按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，依法测定含量，色谱峰结果见表5。计算回收率，计算结果见表6。

表5加样回收试验结果

结果ID样品名称保留时间峰面积

11449加样130.0143342011

21450加样130.012332473

31451加样230.0152881304

41452加样230.0302873186

51453加样330.0133182812

61454加样330.0203202841

71455加样430.0743253358

81456加样430.0703245703

91457加样530.0483274691

101458加样530.0613267313

表6加样回收试验结果（n=5）

2.2.10阴性对照试验

按处方中药味的比例，配制不含陈皮的群药，按其工艺制成阴性对照样品，再按供试品溶液制备方法制备并测定，结果在与橙皮苷对照品相同保留时间处未显色谱峰。

2.2.11样品测定

取三个批号的样品，分别按“2.2.4”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10.00µl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，采用外标法进行测定。根据线性关系计算样品含量。结果见表10。

表7样（090201）检测结果

结果ID样品名称保留时间（min）峰面积平均峰面积峰面积RSD%

11463批次样330.097478813648422361.16

21464批次样330.0824799019

31465批次样430.0774892011

41466批次样430.0634889777

表8样（080715）检测结果

结果ID样品名称保留时间（min）峰面积平均峰面积峰面积RSD%

11459批次样130.043360624235649971.39

21460批次样130.0553609424

31461批次样230.0743521227

41462批次样230.0753523093

表9样（080612）检测结果

结果ID样品名称保留时间（min）峰面积平均峰面积峰面积RSD%

11440批次样130.025340623633719811.31

21468批次样130.0253403329

31441批次样230.0353366901

41442批次样230.0453311459

表10样品测定结果（n=3）

生产批号橙皮苷的含量（mg/g）RSD（％）

0806120.4221.1

0807150.4571.2

0902010.6261.1

3讨论

3.1方中各药主要有效成分

3.1.1杏仁水当中含有苦杏仁苷，苦杏仁苷能分解释放出氢氰酸，有一定的镇咳作用。[8]

3.1.2枇杷叶当中含皂苷、齐墩果酸等水溶性成分。[8]

3.1.3紫菀当中含紫菀皂苷，为水溶性成分，能增加动物呼吸道分泌，而具有祛痰作用。[8]

3.1.4桔梗桔梗含桔梗皂苷及桔梗酸A、B、C等成分，另据报道，桔梗水煎剂给狗口服，能促进支气管粘膜分泌物增多而具有祛痰作用。[8]

3.1.5芦根当中含薏苡素、多聚糖、甜菜碱等成分，又多种免疫活性的多聚糖类化合物（水溶性成分）。[9]

3.1.6陈皮当中含有挥发油及陈皮苷、新陈皮苷等水溶性成分。[8]

3.1.7甘草流浸膏甘草为左使药，调和诸药。

3.2标准中有盐酸麻黄碱的含量测定方法，但实际操作时提取条件对测定结果的影响较大，且其为西药成分，因而考虑增加其中中药成分的检测。陈皮为本制剂中的主药之一，故试验增加其中橙皮苷含量测定的方法。

3.3从上述结果看，三批含量差异较大，可能与制剂的生产工艺、药材的产地、生长年限、采集时间等有关。建议可增加芦根枇杷叶颗粒中橙皮苷的含量测定来控制其质量。

3.4芦根枇杷叶颗粒中还含有一味中药紫菀，为方中君药，其指标性成分紫菀酮也可考虑作为指标性成分之一进行定性检察和定量测定，已有关于含紫菀药材的成方制剂以紫菀酮作为指标性成分的报道[10]。同时，可以根据制剂中的有效成分及指标性成分（如：橙皮苷、紫菀酮、盐酸麻黄碱等）用含量同时测定的方法进行定性和定量分析，同时可以建立芦根枇杷叶颗粒的HPLC指纹图谱，进一步进行定性分析。

3.5实验比较了加甲醇15ml、25ml、50ml，结果显示甲醇25ml较15ml提取的橙皮苷含量高，与50ml无显著差异，故选择加甲醇25ml。超声提取时间分别设定为20min、30min、40min，以30min提取最为理想。

参考文献

[1]王文红，康宏广，王乐云.芦根枇杷叶颗粒制备工艺研究.实用中西医结合临床，2004，4（4）：75

[2]国家药品监督管理局中成药地方标准上升国家标准内科肺系（二）.WS-10944(ZD-0944)-2002

[3]国家药典委员会编.中国药典2005版[S],一部.北京:化学工业出版社,2005:132.

[4]阎东海,林恒彪.呕立舒口服液中橙皮甙的含量测定[J].药物分析杂志,1996,16(3):187.

[5]邓茂芳,潘嬿.HPLC法测定四制香附丸中橙皮苷的含量[J].安徽医药,2005,9(3):7.

[6]徐成志.HPLC法测定木香顺气丸中橙皮苷的含量[J].安徽医药,2007,11(1):36.

[7]张小琼,何燕嫦.HPLC测定珍珠胃安丸中橙皮苷的含量[J].中成药,2006,(3):8.

[8]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1996：504，873，683.

[9]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1977:1078.

[10]张军，于红宇，蔡晓燕，等.HPLC法测定紫菀止咳颗粒中紫菀酮的含量.中药新药与临床药理[J]，2004，15(3):197-199.