Nplate对大鼠长期毒性研究

Nplate对大鼠长期毒性研究

朱海戴小宇

朱海戴小宇（上海第二军医大学药物安全性评价中心200433）

【摘要】目的研究Nplate的长期毒性作用。方法120只大鼠，随机分为4组，低、中、高剂量组和溶媒对照组。每周给药三次，连续给药四周，恢复期四周，观察给药期间大鼠状况。分别于停药期、恢复期各剖杀一半大鼠，进行血液学、血液生化学、免疫学等指标检测，称脏器重量，计算脏器系数，并作病理组织学检测。结果中、高剂量动物与溶媒对照组比较，部分指标有显著异常，停药后各指标恢复或有恢复趋势。结论Nplate有一定的毒性，主要毒性靶器官为血液系统，免疫系统和消化系统，但毒性变化具有可逆性，临床使用时需注意毒性靶器官的毒副作用并控制剂量。

【关键词】Nplate长期毒性大鼠

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）26-0051-02

促血小板生成素（TPO）的主要作用是调节巨核细胞和血小板生成，人体内主要由肾脏、肝脏、骨髓基质细胞生成[1]。基因在1994年被克隆后，出现了繁多的TPO衍生物，其治疗目的更是多种多样，比如对放射病[2]、肝病的救治，但基本都有一定毒性。Nplate是国外研制的一种TPO衍生物，现本中心使用注射用Nplate冻干粉，sc对大鼠四周长期毒性试验，对其毒性进行一定研究，给后续试验提供一定参考资料。

1.材料

1.1供试品Nplate，厂家：AMGEN，性状：白色冻干粉，规格：250μg/支。

1.2动物SPF级SD大鼠，6～8周龄，体重120～140g，主体试验每组20只，卫星组每组10只，雌雄各半，由上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：2008001607994，动物饲养于SPF级动物房。

1.3仪器日立7080全自动生化分析仪；ADVIA2120型全自动血球分析仪；美灵MC10plus血凝仪；CytomicsTMFC500流式细胞仪。

2.方法[3-7]

2.1大鼠长期毒性试验取120只SD大鼠，雌雄各半，按体重均匀随机分为4组，Nplate低、中、高剂量组和溶媒对照组，主体试验组各20只，卫星组各10组。雌雄分开饲养，每笼5只。给药剂量分别为5、15、50μg/kg，按1ml/kg体重sc给药，每周3次，连续四周，d10对卫星组动物麻醉采血，进行血液学、血液生化学、免疫学等指标检测，称脏器重量，计算脏器系数，并作病理组织学检测。给药期间每日观察大鼠症状一次。每日称1次摄食量，每周称1次体重。d28各主体试验组1/2动物进行麻醉取血检测血液学指标、血液生化指标和凝血指标，然后放血处死动物，进行尸检，取其脏器称重，并计算脏器系数。将脏器组织固定保存，并进行病理学检查。d56其余动物，重复上述检查。

3.结果

3.1对动物一般情况的影响给药期间动物一般行为、活动、毛发、大小便、食量、体重均未见明显异常。

3.2对大鼠血液学指标的影响d10时低、中、高剂量组TT降低、PLAT升高，雄性动物EOS%降低，雌性动物HGB降低、MPV升高；中、高剂量组雄性动物MPV升高，雌性动物HCT降低、WBC升高；高剂量组LYMPH%降低，雄性动物HCT、RETIC%降低，雌性动物NEUT%、MONO%升高；其余指标无明显差异。d28时低、中、高剂量组PLAT升高，雌性动物MPV升高；中、高剂量组雄性动物NEUT%、RETIC%、MPV升高，LYMPH%、PAG降低；高剂量组WBC升高，EOS%降低，雌性动物RBC、HGB、HCT、TT降低，NEUT%升高；其余指标无明显差异。d56各指标无明显差异。（见表1）

表1Nplatesc对大鼠血液学指标

注：★p<0.05vs同时间点的溶媒对照组

3.1.3对大鼠血液生化学指标的影响d28时中、高剂量组雌性动物P升高；高剂量组动物AST升高，雌性动物CPK、LDH、P升高；其余指标无明显差异。d56时中、高剂量组雌性动物Tbil升高，ALP降低；其余指标无明显差异。

3.1.4对大鼠免疫学指标的影响各组与溶媒对照组比较d28和d56时均无明显差异。

3.1.5抗体检测结果各组与溶媒对照组比较d28和d56时均无明显差异。

3.1.6骨髓细胞检查结果停药期各个剂量组巨核细胞均有不同程度增生活跃且粒红比例降低或倒置，粒系细胞增生较低下，可见坏死细胞碎片，有核红细胞增生低下，均可见到程度不等的成纤维细胞和纤维细胞及胶原纤维，高剂量组动物可见到裸核及坏死细胞。

3.1.7脏器系数d28时高剂量组雌性动物脾脏、肝脏、肺的绝对重量和相对重量升高，其余脏器重量未见明显异常。d56时未见明显异常。

3.1.8病理组织学检查d28时低、中、高剂量组肝脏间质内髓外造血灶数目明显增多，巨核细胞数目明显增多，汇管区炎细胞浸润亦显著增多，且量-效关系明显。脾脏红髓明显扩增，淋巴细胞数量显著减少，淋巴小结体积亦明显缩小。脾脏红髓和白髓中均散在分布有髓外造血灶，尤以分叶核样巨核细胞的增多最为显著。红髓内散在分布有大量核深染、胞浆嗜酸性的网状内皮细胞增生病灶，部分网状内皮细胞已蜕变为近梭形的类成纤维细胞，且量-效关系明显，d56时以上病变在给药组和溶媒对照组的差别基本消失。

其余器官或组织结构均未见明显器质性病理变化。

3.1.9骨髓检查d28时低、中、高剂量组骨髓内巨核细胞数量轻度增多。d56时给药组和溶媒对照组大鼠骨髓中巨核细胞数量和比例未见明显差异。

4.讨论

长毒动物给药期和停药后的一般情况、体重、摄食量等结果未见明显异常，本试验条件下，Nplate连续四周sc对大鼠毒性作用较轻，动物可以耐受。

血常规检查结果表明给药后中、高剂量组外周血RBC、HGB、HCT略有下降，而RETIC%略有上升。骨髓涂片和骨髓病理组织学检查均观察到半数以上高剂量组动物的髓红系幼稚造血细胞减少。同时在肝脏、脾脏和肾上腺可见明显的代偿性的髓外造血灶，伴随脾脏和肝脏重量的明显增加，停药一个月后可恢复。红系数值的下降的具体机制尚不清楚，可能是由于干细胞竞争，药物刺激血小板生成的同时抑制了红细胞的生成。

血液生化学指标表明给药后高剂量组ALT、AST、ALP升高，同时大鼠停药时肝脏绝对重量和相对重量与溶媒对照组相比显著升高。肝脏重量的变化可能和大量的髓外造血灶的生成有关，但未发现其他严重的器质性病变。药物可能对大鼠肝功能有影响，但程度较轻，停药一个月后可恢复。停药时血清K、P升高，停药一个月后可恢复，推测因血小板释放K和P，此现象可能药物刺激血小板大量生成有关。高剂量血清CPK、LDH升高，停药一个月后可恢复。病理组织学未见心脏、胰腺等有明显的药物相关的病变。是否与供试品作用相关尚不能确定，有待进一步长期的毒性试验确证。抗体的产生与剂量无明显相关性。

5.结论

大鼠以5.0、15、50μg/kg皮下注射给予注射用Nplate，连续给药4周，安全剂量为5.0μg/kg，毒性剂量为15μg/kg。毒性作用靶部位主要为免疫系统（脾脏、骨髓）和血液系统（巨核系、粒系、红系）以及消化系统（肝脏）等，以骨髓纤维化最为显著，停药可恢复或有恢复趋势。临床使用时应注意药物对以上毒性靶部位可能存在的毒副作用，长期使用时注意监测患者网硬蛋白形成情况。

参考文献

[1]周敏,杨默血小板生成素相关分子研究进展[J]实用儿科临床杂志,2009(15).

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