解脲脲原体自配培养基应用评价

解脲脲原体自配培养基应用评价

蔡丹锋1郑宗富2

蔡丹锋1郑宗富2

（1福建省泉州市惠安县医院检验科福建泉州362100；2解放军476医院检验科福建福州362100）

【中图分类号】R446.12【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）30-0257-02

【摘要】目的比较解脲脲原体（Uu）自配培养基与浪峰分离鉴定培养基的符合率，以寻找适应Uu扩增所需廉价高效培养基。方法用甘油冰冻保存菌株，临床标本同时接种自配培养基和浪峰液体培养基，观察并记录解脲脲原体生长的时间、培养基颜色变化的程度及阳性率，然后将三种液体培养基培养阳性标本接种血平板，鉴定以判断杂菌生长情况。结果自配培养基加HEPES、自配培养基无加HEPES和浪峰培养基对甘油冰冻保存菌株的复苏率为98.2%、98.2%、98.2%.对临床标本的分离率为35%、35%、40%。自配培养基与浪峰培养基阳性率(P>0.05)、生长速度(P>0.05)、抑制杂菌能力（P>0.05）无显著性差异。结论自配培养基同浪峰培养基相比在分离阳性率、生长速度和抑制杂菌能力方面达到了浪峰培养基同等效果。

【关键词】解脲脲原体培养基

解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum）是非淋菌性尿道炎（NGU）的主要病原[1]，在我国性传播疾病患者中支原体感染以Uu为主，据报道50%-80%非淋患者中分离到Uu[2]。Uu液固培养法是公认的敏感方法，是新方法评价的“金标准”、是确诊Uu感染的可靠方法[3]目前国内常用的Uu液体培养基是以培养出Uu为终目的的，以培养基颜色变红为判定标准，而当培养基颜色变红时，大量的Uu已经死亡，还存在着抑菌能力差、价格昂贵。为此我们参考文献[7]解脲脲原体尿素培养基进行改良以适应Uu的大量扩增，并将自配培养基在分离阳性率、培养颜色变化程度、抑菌能力与浪峰培养基进行测试比较。

1.材料

1.1甘油冰冻保存菌株：据文献[5]保存的本院细菌室培养阳性标本。

1.2临床标本：分别用无菌棉签或无菌试管收集泌尿系感染患者的生殖道分泌物、前段尿、前列腺液共56份（其中宫颈拭子30份、前列腺液5份、尿液21份）年龄19-55岁，3小时内送达实验室。

1.3培养基：自配培养基成分1640基础培养基70ml，胎牛血清20ml，25%无菌鲜酵母浸出液10ml，40%尿素1.5ml，多粘菌素（5000u/ml）0.5ml，调PH值至6.0，HEPES0.075M3ml；参照试剂浪峰支原体培养鉴定记数药敏试剂（批号20030401）厂家：珠海市浪峰生物技术公司。

2.方法

2.1培养方法(1)甘油冰冻保存菌株复苏后接种。在无菌操作下以生理盐水洗涤甘油冰冻保存菌株,13000r/min离心洗涤2遍，取沉淀物接种自配培养基（加HEPES）和自配培养基（无HEPES），浪峰培养基。(2)临床标本：棉拭子在自配培养基和浪峰培养基中清洗后挤干弃去，同时接种自配培养基，浪峰培养基；尿标本取10ml2000r/min离心10min弃去上清，每次取沉淀同时接种自配培养基和浪峰培养基；前列腺液标本直接接种液体培养基，同时设空白对照，各管加石蜡油2滴。置于37C水浴箱培养。

具体操作如表

2.2结果观察：接种10h后每隔2h观察培养基的颜色变化，培养基指示剂呈橙色/红色清亮定为阳性为Uu生长的指征。与空白对照比较，记录三种培养基颜色变化的时间，观察至48h，若48h培养基颜色仍未变化者定为阴性。

3.阳性及假阳性的鉴定

3.1血平板接种：将经自配培养基和浪峰培养基培养阳性标本以无菌方式接种10%羊血平板，24-48h观察是否有细菌生长。

3.2革兰染色并接种尿素管：从分离血平板取菌落接种于尿素管中，同时做革兰染色，次日培养基变红者，定为杂菌能分解尿素。

3.3PCR将自配培养基和浪峰培养基培养阳性标本行PCR聚合酶链反应以检测杂菌的生长情况[6]。

4.结果

4.1自配培养基与浪峰培养基对甘油冰冻保存菌株的复苏阳性率比较：自配培养基和浪峰培养基对甘油冰冻保存菌株的复苏率分别为90%和95%。差异无显著性（χ2=1.02，P>0.05）其中有一例自配培养基加ＨEPES呈阴性而无加HEPES和浪峰培养基呈阳性.

4.2自配培养基与浪峰培养基对临床标本的分离阳性率比较:自配培养基的分离阳性率为35%;浪峰培养基的分离阳性率为40%,差异无显著性（χ2=1.02，P>0.05）。共有2例自配培养基阴性,而浪峰培养基阳性,1例自配培养基阳性而浪峰培养基阴性。

4.3自配培养基与浪峰培养基生长速度的比较:自配培养基加HEPES缓冲剂,自配培养基无HEPES缓冲剂,浪峰培养基三者以浪峰培养基生长速度最快,自配培养基加HEPES缓冲剂最慢.见附表

5.讨论

由于Uu的培养较为困难，营养要求高，本试剂用1640为基础培养基以提供适宜的电解质环境，用胎牛血清以提供足够的胆固醇、脂肪酸和蛋白质，鲜酵母浸出粉提供核苷前体、维生素及刺激生长的某些成分。因为现有的培养基都是以鉴定出Uu为终点，而当培养基颜色变化时，Uu代谢产生的毒性物质和PH值上升严重干扰Uu的继续生长甚至引起Uu的死亡。由于Uu的最适生长PH值5.5-6.5，Uu又会分解尿素而使PH值升高，在其中一份自配培养基加入0.075MHEPES缓冲剂，在PH值7.2-7.6缓冲作用较强，不受大气CO2的影响，适宜Uu的生长，使Uu的生长达到10[6]-10[7]菌形成单位，而另一份不加HEPES缓冲剂，培养基颜色变化快指示着Uu生长情况。同时加0.002%酚红敏感指示剂。用三蒸水减少离子成分对Uu培养的干扰。由于培养法确定Uu阳性是依据能否分解培养基中的尿素，PH值上升，使酚红指示剂有黄变红，某些细菌也可分解尿素，而用于Uu培养的标本（宫颈拭子、尿液、前列腺液）此类标本都是开放性的材料，本身已不同程度带有细菌，国内商品化的Uu液体培养基经济方便，实用于临床常规检测由于国内Uu培养基普遍存在抑制杂菌能力差[8]，但本培养基中加入抑菌能力极强的多粘菌素，抑制了几乎所有的其它的细菌生长，自配培养基和浪峰培养基培养阳性标本接种血平板分离出的细菌表明：在自配培养基和浪峰培养基中生长的杂菌主要为革兰阳性球菌。

参考文献

[1]徐金华，杨蜀嵋，徐明，等.淋病患者合并解脲脲原体及沙眼衣原体感染的研究.中华流行病学杂志，1998；19：81.

[2]石荣珍，李华.泌尿生殖道支原体感染的研究.热带医学杂志，2002；2：190.

[3]李慎秋.以尿道炎表现的男性性病患者支原体感染的研究.医药导报，2002；6，21：341.

[4]曹玉璞，叶永康.支原体培养方法，支原体与支原体病.北京：人民卫生出版社，2000，292-294.

[5]吴汉勇，吴发龙.解脲脲原体保存方法探讨，福建医学杂志，1997，6（19）：149.

[6]陈波，黄海樱，吴晓蔓.61例解脲脲原体液体培养基变红及浑浊原因探讨.中国卫生检验杂志，2001，10，11（5）：587.

[7]方晓霞，俞树高，高瑞珍，等.四种检测解脲脲原体单管培养基的比较实验观察.中国人兽共患病杂志，1999，15：65-67.