青蒿素类抗疟药的抗疟机制及耐药机制的研究新进展

青蒿素类抗疟药的抗疟机制及耐药机制的研究新进展

孙雪英代勇

孙雪英代勇（通讯作者）（成都中医药大学病理学教研室四川成都610075）

【摘要】青蒿素及其衍生物是一类全新结构的抗疟药，因其抗疟作用迅速、高效、低毒且与大多数抗疟药无交叉抗性等特点而成为目前全球抗疟的主要药物。近年来已有青蒿素类药物治疗失败的临床疟疾病例报道，最近的资料显示局部地区有青蒿抗性疟蔓延扩展的趋势，青蒿素类抗疟药抗疟机制及耐药机制的研究已然担负起延长青蒿素类药物使用寿命的重任。本文章就近期有关青蒿素类药物抗疟机制及耐药机制的进展做一综述，以期为抗疟机制的进一步研究及新药研发做出讨论并寻找新的突破口。

【关键词】青蒿素抗疟药抗疟机制耐药

青蒿素(Artemisinin)是20世纪70年代我国科技工作者从青蒿植物中分离并鉴定的一种含有过氧基团的倍半萜内酯，是继氯喹、乙氨嘧啶、伯胺喹后最热的抗疟特效药，尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。青蒿素类药物因其具有抗疟作用迅速、高效、低毒且与大多数抗疟药无交叉抗性等特点，逐渐在全球抗疟疾斗争中扮演主角,成为世界卫生组织推荐的抗疟药品。近年已有青蒿素治疗失败的临床疟疾病例报道，最近的资料显示局部地区有青蒿抗性疟蔓延扩展的趋势，因此青蒿素类抗疟药抗疟机制及耐药机制的研究将担负起延长青蒿素类药物的使用寿命的重任。本文就近期有关青蒿素类药物抗疟机制及耐药的相关研究进展做一综述，以期为抗疟机制下一步研究及新药研发做出讨论并寻找新的突破口。

1青蒿素类药物抗疟机制

早期观点认为青蒿素类化合物抗疟作用属于氧化性机制，分子中必须有过氧基团[1,2]。迄今证实，自由基与青蒿素类药物抗疟活性之间的重要关系，亚铁血红素或其他的生物大分子络合的亚铁，在药物活化中起了关键作用[3-6]。学者们通过对青蒿素结构中过氧桥的详细研究，将青蒿素的抗疟原理归纳为两个步骤：青蒿素的过氧桥在低价过渡态的金属离子介导下还原分解形成自由基，继而和疟蛋白结合。

1.1亚铁离子介导的过氧桥裂解

1992年工作者首次提出亚铁离子介导的过氧桥裂解产生一对氧阴离子自由基，两者分别经过β裂解和1,5-H迁移重排为C4位的伯碳自由基和仲碳自由基，并进一步转化为不同的产物[7]。之后不断有学者用各种化学模型体系对体外青蒿素及其衍生物亚铁介导的还原裂解进行研究，鉴定了一些中间产物和终产物。由于选用不同反应条件，得到的产物组成不尽相同，但所有结果都表明了伯碳自由基和仲碳自由基在青蒿素类衍生物还原裂解反应中的重要地位。吴毓林等认为1,5-H迁移需要的能量，通过结构轻微的扭曲就可达到迁移要求[8]。这一观点随后得到量子理论证实，表明伯碳自由基和仲碳自由基都比其前体或相应过渡态更为稳定，两者的形成是一个不可逆的热动学过程[9,10]。有学者认为C4β-取代有利于1,5-H迁移产生更稳定的叔碳自由基并认为此种途径的迁移重排与青蒿素类药物高抗疟性密切相关[11]。研究证实：过氧桥邻近或其他碳原子上的α-取代因立体阻碍活性降低[12]。C4β-取代能稳定重排产生的C4自由基而又不阻碍亚铁结合，因而增强抗疟活性，表明C4自由基是青蒿素类药物抗疟活性所必须。近期，梁瑞玲等计算了青蒿素的过氧桥键在二价铁离子作用下裂解并与Fe2+形成环状加成产物的反应路径，以此来模拟青蒿素的抗疟机制。根据计算结果，在二价铁离子的影响下，青蒿素过氧桥键逐渐断裂，两个氧原子与铁离子以共价键结合生成不稳定络合产物，加成产物在外界条件影响下裂解，并发生铁离子的迁移，最终脱去铁离子，形成两个氧自由基。她们认为，加成产物的形成是青蒿素发挥抗疟作用的重要环节[13]。此观点对确定O=Fe2+在青蒿素类衍生物还原裂解中的地位提供初步依据，但还需更多研究进一步证实。

1.2青蒿素类药物烷基化疟原虫特异性蛋白

治疗浓度的放射性标记的青蒿素衍生物与疟原虫感染红细胞反应时，有六个疟原虫蛋白被特异性标记[14]，其中之一鉴定后是翻译控制肿瘤蛋白（translationallycontrolledtumorprotein，TCTP）。研究证实了恶性疟原虫重组TCTP在血红素催化下能与双氢青蒿素发生共价结合。进一步研究发现，TCTP与血红素的亲和力与人的血清清蛋白类似。TCTP上单个半胱氨酸部分被阻断时，其与血红素的连接不受影响，与药物的结合却减少。因此推断，半胱氨酸可能是双氢青蒿素和TCTP反应的桥梁，而TCTP很可能是青蒿素类药物的作用靶点。目前TCTP的功能以及其与药物结合与抗疟作用的相关性仍未得到研究证实。曾有学者在实验中通过对青蒿素进行结构改造合成了青蒿素衍生物（酸），其与含有亲水性连接臂的生物素衍生物(胺)，通过酰胺键相连首次成功地合成了第一例稳定的生物素标记的青蒿素衍生物[15]。这一衍生物的合成将为证明青蒿素的靶标蛋白提供依据，也可能成为探究青蒿素抗疟机制的便利途径。

Krishna及其同事的研究发现：青蒿素高选择性抑制异源表达的恶性疟原虫PfATP6（肌浆/内质网膜Ca2+-ATPase，thesarco/endoplasmicreticulumcalcium-dependentATPase,SERCA）活性，而氯喹、奎宁和脱氧青蒿素无此作用[16]。PfATP6通过将钙离子排出细胞外调节细胞内钙水平。青蒿素在亚铁活化后与PfATP6不可逆结合并抑制其活性，使细胞内钙水平升高，可能是导致疟原虫死亡的原因。但是目前并未证实治疗浓度下活化的青蒿素与PfATP6结合。娄凤文首次提出了青蒿素分子以疟原虫体内的生物活性物质辅酶A分子作为靶标的抗疟机制的新模型，并从生化原理和实验上对青蒿素类药通过辅酶A对疟原虫的致死作用给出了合理的解释[17]。

亚铁血红素作为药物活化所必须，而近期这一共识受到了挑战：首先是吴毓林等发现在半胱氨酸存在时痕量的非血红素铁也能快速裂解青蒿素并产生一未知的醛类化合物，同时还认为疟原虫功能蛋白酶或酶络合的亚铁离子才是药物活化所必需，并提出青蒿素类药物的作用靶点是疟原虫含铁的关键酶或功能蛋白[18]；另外，Krishna及其同事证实青蒿素类药物分布于疟原虫细胞质的膜系结构，而不是积聚于食物泡，用plasmepsin抑制剂阻断血红蛋白水解释放亚铁血红素也不影响青蒿素的作用。目前尚需更多的证据支持非亚铁血红素的重要性，也需要进一步的研究以直接表明亚铁血红素与药物无关。目前多数学者认同青蒿素类药物抗疟机制是多个特定的自由基作用于特定的靶点来实现的。

2青蒿素类药物的耐药机制

早期实验室已成功培育出中度耐药的青蒿素抗性株，在培育耐药株过程中，鼠疟原虫和体外选育的恶性疟原虫对青蒿素产生耐药性的发展较为缓慢和不稳定，并且耐药性指数不高，一旦撤药，耐药株就会恢复敏感性。普遍认为疟原虫对青蒿素类药物产生耐药性是药物压力下相应基因表达改变，从而引起作用靶点蛋白的表达量改变的结果[19]。临床上基于青蒿素类药物半衰期较短，疟原虫不可能有足够长时间暴露于治疗浓度药物压力下；经青蒿素治疗后病人体内配子体形成受抑制，再感染并传播的机会降低；再者青蒿素类药物多与其他抗疟药联合应用，因此普遍认为青蒿素类药物抗性产生会更为缓慢。而2010年5月抗青蒿素疟疾在柬埔寨、泰国与柬埔寨边境等东南亚地区得到证实，其抗性在几年前已出现。

在约氏疟原虫耐青蒿素虫株中，TCTP同系物的表达量高于敏感株，因此TCTP表达的上调证实可能与药物作用机制有关并可能是青蒿素类药物抗疟作用的靶点之一[20]。有大量研究证实疟原虫对青蒿素类药物的敏感性变化与其遗传学改变有关，如恶性疟原虫多药耐药性基因序列(Plasmodiumfalciparummulti—drugresistancegenesequence，简称pfmdr1)和恶性疟原虫氯喹耐药性转运蛋白(Plasmodiumfalcipa—rumchloroquineresistanttransporter，简称pfcrt)的基因序列。鼠疟和恶性疟的研究均发现疟原虫多药抗性基因拷贝数增加与青蒿素敏感性下降有关[21]。但在鼠疟青蒿素抗性稳定株中，发现PfATP6、pfmdrl和pftctp相应基因没有任何变化[22]。据推测可能是鼠疟原虫与人疟原虫有较大生理差别，青蒿素类药物的敏感模式与恶性疟也有较大差别。最新研究显示：泰缅边境青蒿素治疗的疟原虫清除半衰期延长的同时，疟原虫缓慢清除感染的比例增加；另外，对部分感染者的基因型进行研究确定了148个多肽疟原虫基因。疟原虫缓慢清除率由于疟原虫遗传学的变大而逐渐上升，照此增长趋势，在未来2到6年内泰缅边境抗青蒿素疟疾将达到柬埔寨西部水平[23]。这一研究证实疟原虫遗传学改变是青蒿素抗性产生的关键，但也可能存在一些目前还没有证实的青蒿素药物靶点或药物转运相关蛋白。

3结语

综上所述，青蒿素类抗疟药的抗疟机制是在亚铁或其他来源亚铁介导下，过氧桥裂解为氧自由基并重排为碳自由基，进一步通过烷基化疟蛋白，发挥抗疟作用。青蒿素活化为碳自由基和青蒿素在疟原虫体内过程是抗疟的关键。青蒿素类抗疟药的抗疟机制是特定的自由基作用于特定靶点来完成，并可能存在多个药物靶点，也因此为其抗疟机制的研究带来难度。随着青蒿素耐药性疟疾临床病例的报道，抗疟机制的研究也将进入迫切阶段。整体而言，青蒿素类药物的抗疟机制以及耐药机制是否有相同的药物作用靶点，还需有针对性的研究，以有利于延长青蒿素类药物临床使用寿命及新药研究。

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