基因芯片技术对非综合征型耳聋基因突变的检测

基因芯片技术对非综合征型耳聋基因突变的检测

阿曼古丽·牙生朱有森杨立

阿曼古丽·牙生朱有森杨立(通讯作者)

(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】目的:应用遗传性耳聋基因芯片对非综合征型耳聋患者进行分子病因学检测，评估其在遗传性耳聋快速基因诊断中的可行性。方法：采集96例耳聋患者外周血，提取基因组DNA，遗传性耳聋基因芯片检测中国人中常见的4个耳聋相关基因的9个突变,即GJB2(35delG,176dell6bp，235delC及299delAT)、GJB3(C538T)、SLC26A4(IVS7—2A>G、2168A>G)和线粒体DNA12SrRNA(A1555G、C1494T)。结果：96例耳聋患者共检出16例携带致聋突变(16.67％)。其中GJB2基因突变9例(9.38％)、SLC26A4基因突变7例(7.29％)、未检出GJB3基因突变和线粒体DNA12SrRNA基因突变。结论：遗传性耳聋基因芯片技术对中国人常见耳聋相关基因热点突变的检出率高，具有快速、准确、高通量、低成本等特点，能够满足临床耳聋基因检测的要求，具有广阔的临床应用前景。

【关键词】耳聋基因突变基因芯片

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）15-0041-01

耳聋是最常见残疾之一,我国现有耳聋人数约2004万,新生儿耳聋的发生率为0.1%～0.3%[1],其中约50%属遗传性耳聋[2]。在70%-80%的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变[3]。国内耳聋分子流行病学研究表明，我国大部分遗传性耳聋主要由为数不多的几个基因突变引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4以及线粒体12SrRNA等[4、5]。由于遗传性耳聋遗传异质性强、突变位点多，以及人群患病率及携带致病基因比例高，建立快捷、高通量的基因诊断方法十分必要，传统的检测方法（如RFLP、DHPLC、测序等）均很难做到同时检测不同基因或同一基因的不同突变位点。而基因芯片技术以其固有的平行高效的检测特点，有望成为一种极具潜力的耳聋基因诊断和筛查工具。在本次研究中，我们使用了遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒检测96例非综合征型耳聋者，以评价基因芯片技术应用在遗传性耳聋基因快速检测的实用性和可行性。

1材料和方法

1.1材料

研究对象全部来自新疆医科大学第一附属医院和新疆维吾尔自治区人民医院，共96例，全部为非综合征型耳聋患者，年龄从1岁-55岁。经知情同意后，对所有研究对象进行病史调查，包括患者一般信息、耳聋发病年龄、家族史、个人史(耳聋前传染病史，耳毒性药物应用情况，头部外伤史等)、患者母亲孕期情况和体格检查等。晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒、微阵列芯片扫描仪及相应的遗传性耳聋基因芯片判别系统等均为博奥生物有限公司产品，全血基因组DNA提取试剂盒为QIAGEN公司提供。

1.2方法

1.2.1标本：采集外周静脉血5ml(枸橼酸钠抗凝)，用全血核酸提取试剂盒提取全血基因组DNA。

1.2.2PCR反应：9个突变位点的9组引物分成A和B两个反应体系分别进行多重PCR，在每个反应体系中加入待测全血基因组DNA(浓度100-200ng/u1)3ul，扩增引物混合物12.5ul，扩增试剂混合物4.5ul。PCR反应程序：37℃10min，95℃15min，96℃1min预变性，94℃30s、55℃30s、72℃45s共32个循环，70℃45s，60℃l0min。

1.2.3杂交：PCR产物95℃变性10min后，立即浸入冰水混合物中冰浴3min。从同一样品模板的两个不同扩增体系管(A、B)中各取2.5ulPCR产物加入到10ul杂交缓冲液管中。将14ul杂交混合液加到芯片的微阵列区域，加盖玻片，封闭杂交盒，然后放入50℃预热杂交箱中保温lh。

1.2.4洗片：取出芯片在42℃洗涤液I中摇床洗涤2min，取出放入已经预热42℃洗涤液Ⅱ中洗涤2min后甩干。

1.2.5结果判定：用晶芯针LuxSeanTM10K／B微阵列芯片扫描仪对芯片进行扫描，每次试验均设正常对照及空白对照各一份。

2结果

96例标本中共检出16例携带致聋突变，阳性率为16.67％。其中9例(9.38％)GJB2基因突变，包括2例235delC纯合突变，1例35delG／235delC复合杂合突变，4例235delC单杂合突变,1例35delG纯合突变,1例176del16杂合突变；7例(7.29％)SLC26A4基因突变，包括2例IVS7—2A>G纯合突变，3例IVS7—2A>G单杂合突变，1例2168A>G单杂合突变，1例2168A>G／IVS7-2A>G复合杂合突变。

3讨论

耳聋是影响人类健康和造成人类残疾的常见原因之一，我国听力语言残疾者达2057万以上，并以每年新生3万聋儿的速度增长，其中50％以上与遗传因素有关，而70％的遗传性耳聋表现为非综合征型耳聋（Non-SyndromicDeafness，NSHI）。NSHI具有高度的遗传异质性，其遗传方式有常染色体显性、隐性遗传，X连锁遗传和线粒体DNA突变的母系遗传，不同的遗传方式涉及多个基因突变。随着人类基因组计划的实施和完成，耳聋致病基因的发现取得了很大的进展。

遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中不尽相同，有很强的种族特异性[5]。国内进行的耳聋分子流行病学调查显示，21％的耳聋患者带有GJB2基因突变14.5％的患者带有SLC26A4基因突变、3.8％和0.6％的患者分别带有线粒体DNAA1555G和C1494T突变。这一调查结果确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因是导致中国大部分遗传性耳聋发生的最常见的3个基因[5]。在本次研究中，用基因芯片检测了96例耳聋患者，共检出16例突变，其中GJB2基因突变9例，SLC26A4基因突变7例，线粒体基因突变1例，携带率分别为9.38％和7.29％，该芯片检测结果与全国范围内进行的聋病分子流行病学调查结果并不完全相符,是否GJB2基因突变不是广东地区遗传性耳聋的主要致病基因还有待进一步调查。

本研究表明，遗传性耳聋基因芯片对中国人中常见耳聋相关基因突变位点检出率高，可满足临床耳聋基因检测的要求，结合产前诊断技术能有效预防耳聋患者的出生，减少家庭负担，该技术还具有快速、高准确性、高通量、平行高效等优点，具有广阔的临床应用前景。

参考文献

[1]张华，刘宇清，王幼勤等.遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志.2009,23(22):1032-1035.

[2]陈鑫苹,符生苗,徐卫华等.遗传性耳聋基因芯片检测的临床应用研究[J].现代预防医学，2012,39(17):5103-5105.

[3]江凌晓，凌月仙，蔡桂君等.遗传性耳聋基因芯片检测的临床应用研究.分子诊断与治疗杂志，2011，5(3):170-172.

[4]张艳,卞颖华,许鹏飞,等.应用耳聋基因芯片技术检测非综合征型耳聋基因突变[J].生物技术通讯,2010,21(1):22-26.

[5]王冰,徐洁,姚红兵,等.重庆市非综合征型耳聋患儿GJB2基因突变分析[J].重庆医学,2009,38(9):1028-1031.