实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析探讨

实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析探讨

周梅

宁明县疾病预防控制中心广西崇左532500

摘要：目的：探讨在流感病毒检测中采用实时荧光定量PCR仪进行检验的临床效果。方法：选择我院2018年1月至2018年12月收治180例流感病样病例为研究对象，使用咽拭子采集标本，使用实时荧光定量PCR法进行流感病毒核酸的测定，如果为阳性则执行MDCK培养同时进行分离，评估检验结果特异性、灵敏度的差异。结果：实时荧光定量PCR仪检出阳性64例，阳性率为35.56%（64/180），细胞培养法分离出流感病毒35例，阳性率为19.44%（35/180），PCR仪检验阳性率高于细胞培养法，P<0.05。细胞分离培养法对实时荧光PCR法的灵敏度、特异性分别为54.69%（35/64）、100.00%（116/116）。结论：对流感病毒检测采用实时荧光定量PCR仪效果更为理想，值得推广。

关键词：实时荧光定量PCR仪；流感病毒；细胞培养法

目前随着国内抗生素滥用问题的不断提出，流感病毒的耐药性也不断增加，并呈现出了变异高度化的特征，各种新型、亚型流感病毒不断出现，导致流感病毒防控的形势空前严峻，一旦出现疫情，如果未实现有效的检测与控制，很容易带来严重的危害。为实现对流感病毒的有效预防与控制，及时进行检出的非常有必要的[1]。为此探讨检验流感病毒的有效方法，本次研究以我院收治流感病样病例为研究对象，评估了实时荧光定量PCR仪检验的应用效果，结果显示采用实时荧光定量PCR仪检测效果更为理想，故现报告如下。

1.资料与方法

1.1临床资料

选择我院2018年1月至2018年12月收治180例流感病样病例为研究对象，使用咽拭子采集标本。该180例患者中包括男86例，女94例，年龄18~72岁，均数（38.52±4.67）岁。所有患者体温均大于38℃，同时存在咳嗽、咽痛等症状。对所采集的标本，均存储于3ml的标本试管之中，后在24h内送检。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR仪检验：对所采集的所有标本，均进行病毒核酸检测，按照试剂盒说明进行RNA提取与反应体系，并利用SDS软件进行PCR系统的操控，完成阳性、阴性对照组的设立。在反应的过程中分为5个循环与40个循环，在5个循环时，50℃设置30min，55℃设置3min，95℃设定为15s，50℃设定30min、72℃设定1min[2]。40个循环时，95℃设置10s，55℃设置40s，设定荧光素FAM，在55℃时，即可进行荧光信号的收集。

1.2.2细胞培养法：对于PCR仪检验为阳性的标本，均采用细胞培养的方法完成分离、接种、分类的工作[3]。在操作的过程中，以25ml/瓶的比例完成对标本的接种，每份标本接种2瓶，次日即可观察是否存在细胞病变，后利用豚鼠血开展血凝实验，判定血凝素及其滴度，如果血凝素的滴度在1:8以下，或2袋以后仍然为阴性，则可抛弃标本。另外结合国家流感中心所供应的标本参照血清，对满足血凝素滴度实验标准的患者试验HAI，完成对病毒类型的划分。

1.3观察指标

对比两组方法的检出阳性率，并评估其检测的灵敏度以及特异性。

1.4统计学方法

数据采用SPSS21.0处理，设定P<0.05，差异有统计学意义。

2.结果

实时荧光定量PCR仪检出阳性64例，阳性率为35.56%（64/180），细胞培养法分离出流感病毒35例，阳性率为19.44%（35/180），PCR仪检验阳性率高于细胞培养法，P<0.05（X2=6.517，P=0.011）。细胞分离培养法对实时荧光PCR法的灵敏度、特异性分别为54.69%（35/64）、100.00%（116/116），详见表1。

3.讨论

在流感病毒的实验室诊断中，分离、鉴定病毒属于临床较为常见用的方案，通过细胞培养的方式能够维持分离流感病毒和采集流感病毒标本的一致，有利于后期对病毒抗原性以及基因的分析。但需要注意是，采用MDCK细胞所分离而得的病毒不能用于疫苗的生产中，而细胞培养法的检出率与病毒的载量、采集标本的质量等存在一定的关系，如果质量不高或者是病毒载量过少，容易出现假阴性的现象，另外该法也仅仅适用于活体病毒，在应用细胞培养法时，需要确保标本中病毒的活性[3]。PCR即聚合酶链反应，通过该反应能够实现对特定核苷酸片指数级的扩增，在反应完成之后，利用凝胶电泳的方式则可实现对扩增物的定性分析，配合利用放射核素标记，加以光密度扫描，则可实现定量分析。在实时定量PCR法检验的过程中，可通过扩增反应增加反应产物，随之荧光信号也会进一步增强，每经过1次循环，就会采集到更强的荧光强度信号，而后则可形成荧光扩增曲线图[4]。该检验方法可在2.5~4h内完成病毒RNA的提取，对流感病毒尤其是甲型流感病毒有着较高的特异性，准确性高，检出率高于细胞培养法、血清学诊断法等，如其在2009年的甲型H1N1流感中就发挥出了重要的作用。但该方案需要实验室配置有特殊的仪器，且对人员操作水平有一定的限制，难以全面普及。而本次研究中，采用实时荧光定量PCR仪检出阳性率高于细胞培养法，P<0.05，表明该方案效果理想，有利于流感病毒高效、准确的检出，验证了实时荧光定量PCR仪应用于流感病毒检测的应用价值。

综上所述，对流感病毒采用实时荧光定量PCR法检验效果理想，特异度与灵敏度高，且检验的时间较短，优势显著，值得在临床中推广应用。

参考文献：

[1]史志坤.实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析探讨[J].中国医疗器械信息,2018,24(21):133-134.

[2]李雨纯.实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用[J].中国城乡企业卫生,2016(12):37-38.

[3]周雪花.实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用[J].中国卫生产业,2014,26(28):178-179.

[4]杜锴.实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA的价值分析与研究[J].中国现代药物应用,2017,11(1):55-57.