总黄酮的含量测定法的研究概况

总黄酮的含量测定法的研究概况

王继平云彪乔忠

王继平云彪乔忠（内蒙古北方重工集团医院药剂科014030）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)11-0116-03

【摘要】黄酮是一类生理活性显著、种类繁多的天然产物。大量研究表明，黄酮类化合物具有止咳去痰、增强心脏收缩等作用。本文对近几年中药总黄酮含量测定的常见方法进行了概述，为中草药黄酮含量的测定提供理论依据。

【关键词】总黄酮含量测定

黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物，以唇形科、玄参科、爵床科、菊科等植物中最常见。黄酮类化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构，是天然酚类性化合物之首。该类化合物具有颜色，易与葡萄糖或鼠李糖结合成苷，少部分为游离态或与鞣质结合存在。黄酮类化合物检测方法从单一的分光光度法、比色法发展到高效液相、毛细管电泳等技术的联用等。本文对近年来中药总黄酮含量测定的方法综述如下。

1紫外可见分光光度法

1.1紫外可见分光光度法

该法是利用某些物质的分子在200～800nm光谱区的吸光度来进行分析测定的方法。一般以中草药、中药制剂自身所含的黄酮类化合物作为对照品，在紫外区或经显色后在可见光区，选择对照品的最大吸收波长处进行测定。陈思妮[1]等以芹菜素为对照品，在272nm处，2.144～10.72μg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系时测定广金钱草中总黄酮的含量。陈栋[2]等测定二冬膏复方中总黄酮的含量不低于0.003%，平均回收率为95.77%，RSD=1.61%，n=5。实验结果显示，以分子吸收光谱为基础的紫外-可见分光光度法具有设备简单、适用性广、准确度和精密度较好等特点，已在中药总黄酮含量分析中发挥着重要作用。

1.2比色法

测定含量时，供试品中加入显色剂后再测定吸光度，这种紫外可见分光光度的方法又称为比色法。据文献报道，黄酮类化合物分子中若具有3-羟基、5-羟基或邻二酚羟基，则易于与金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应，生成有色金属络合物，这些络合物作用在光谱上能产生明显的变化，吸收峰红移。常用于黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al(NO3)3、A1C13等。

在采用比色法进行测量时，要注意考察吸光度值的稳定性，在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系中，碱性条件经常会影响结果的准确性和稳定性，只有物质中含有邻二酚羟基，并且邻二酚羟基的邻位没有取代时，Al(NO3)3比色法才在510nm左右有最大吸收。例如，测定肉苁蓉总黄酮含量时，以芦丁为对照品,以亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为显色剂，在510nm对其含量进行测定[3]。同法操作，程振芳[4]等研究表明，蓝盆花总黄酮提取量、提取次数具有一定的显著性。首次运用微波技术从淡竹叶中提取总黄酮，不仅反应速度加快，总黄酮的含量也明显提高[5]。

由于中药成分复杂，对总黄酮测定中产生各种干扰，故在实际测定中，均以显色测定法最为常见。

2薄层扫描法(TLCS)

样品经薄层分离后直接测定，也可经适当处理后使之显色或产生荧光，在特定波长下用光度计测定其吸光度或荧光强度的方法称为薄层扫描法。于玲等[6]是用双波长薄层扫描法测定冬凌草片中总黄酮的含量，该法也适用于蒲公英总黄酮的测定[7]。结果表明，双波长薄层扫描法测定总黄酮含量时，操作简便,结果可靠,重复性好。

薄层扫描法具有快速、简便、同时可测定多个样品的特点，因而在中药及其制剂的研究中具有广泛的应用，可进行中药的成分研究和含量测定也常用于中药鉴别。

3高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法是在液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的一种重要的分离分析方法。HPLC法是先使用水解法将黄酮苷水解为黄酮苷元后，再进行HPLC分析。该法在测定银杏缓释片和沙棘籽渣中总黄酮苷的含量时，具有分离效能高，分析速度快，灵敏度高等特点[8-9]。

紫外检测器(UV)是使用最普遍的检测器，具有灵敏度高(最小检出量可达10-7-10-12g)，不破坏样品，可用于梯度洗脱等特点。UV检测器中的光电二极管阵列检测器（DAD）最为常用。它不仅能显示3D-光谱-色谱，而且能很容易判断色谱成分的最大吸收波长，进行定性和定量分析。但紫外检测器有一个最大的不足，即只能检测有紫外吸收的样品。同样的问题存在于荧光检测器中，它比紫外检测器还灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。

示差折光检测器虽然是泛用型检测器，因受温度影响较大，灵敏度不够高，以前多用于糖类的检测，现在已被蒸发光散射检测器代替。化学发光检测器和电化学检测器都具有很好应用前景，不仅提高了高效液相的检测的灵敏度和准确度，而且可以连续检测中药中的多种黄酮成分，得到事半功倍的效果。

4荧光分光光度法

黄酮化合物的荧光光度测定法尚不多见。桑色素为3，5，7，2′,4′-五羟基黄酮，常被用作黄酮类化合物荧光光度测定法的标准，多用于铍的荧光光度测定，具有很高的灵敏度。当黄酮分子中具有3-羟基(或5-羟基)时，可与Al3+、铍等离子配位络合显色，成为荧光光度测定黄酮类化合物的基础。银杏叶中黄酮含量的测定时，采用Al-桑色素二元络合物的荧光光度法，结果准确，灵敏度高,并且成功的运用于测定银杏叶中总黄酮的含量[10]；同步荧光法为测定三月泡叶中总黄酮含量的新方法，操作简便、快速、准确,具有良好的应用前景[11]。

5毛细管电泳法

毛细管电泳法是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速的电泳分离新技术。常用的方法主要有毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动力学毛细管色谱(MEKC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等速电泳(CITP)等。

毛细管电泳法的各种操作模式都能很好的用于中药成分含量分析。A.Muller等[12]对电泳缓冲液的浓度、PH值等条件进行优化，采用胶束电动力学毛细管色谱(MEKC)对黄酮含量进行测定。

毛细管电泳还可以结合一些其他领域的技术方法，对中药总黄酮含量进行测定。例如，毛细管电泳技术和电化学技术相结合，对中药黄酮的含量进行分析，同样可得到满意结果；毛细管区带电泳-电化学方法测定中药槐米中芦丁和槲皮素的含量时，芦丁槲皮素质量浓度与电泳峰电流分别在7.5×10-7-1.0×10-3和5.0×10-7-1.0×10-3mol/L范围内呈良好线性关系[13];毛细管区带电泳(CZE)法也可用于芦丁和槲皮素含量的测定[14]。

6其他含量测定法

随着学科相关性的深入，共振散射光谱法、单扫示波极谱法也逐渐应用于黄酮的含量测定。采用近红外漫反射光谱法对已知总黄酮含量的样品在1100-2500nm处扫描建立样本数据库，对预测样品进行分析。结果表明，预测值与HPLC真值的相关系数(r)为0.973，提高了准确度和检测效率[15]。

此外，流动注射法-化学发光，电化学法和免疫化学发光，这些检测灵敏度高的分析方法也将逐步应用于中药总黄酮的含量测定。

7总结与展望

目前,体外对黄酮类物质的测定一般有比色法、紫外分光光度法、HPLC法、薄层扫描法,其中比色法和紫外分光光度法的专属性较差,误差较大。在实际生产和科研过程中，HPLC法适用于黄酮单体含量的测定，而对总黄酮的测定，以UV法常见。

随着科技的发展与学科的交叉，在仪器的灵敏性和精确性方面加以改进，提高黄酮含量测定的准确性，才能促进药物分析更快的适应中药现代化的发展。

参考文献

[1]陈思妮,张振秋.紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量[J].中华中医药学刊,2007,12(5).

[2]陈栋,许腊英,王松,等.分光光度法测定二冬膏复方中总黄酮的含量[J].湖北中医杂志,2009,31(1):56-57.

[3]夏热帕提·吐孙,艾来提·苏里坦,买吾兰江,等.肉苁蓉总黄酮含量的测定[J].生物技术,2008,18(4):52-54.

[4]程振芳,王晓琴,王继东.蒙药蓝盆花中总黄酮的提取工艺研究[J].中国民族医药杂志,2001,10(4):25-26.

[5]王自军,边丽,齐誉.淡竹叶中总黄酮的微波提取与含量测定[J].现代食品科技,2005,1(21):82-84.

[6]于玲,卢静华,姚丹.双波长薄层扫描法测定冬凌草片中总黄酮的含量[J].时珍国医国药,2008,19(3)：36-38.

[7]王亚娟,卢敬华,于铃.双波长薄层色谱扫描法测定蒲公英总黄酮含量[J].数理医药学杂志,2007,20(3):408-409.

[8]谭培汉.HPLC法测定银杏缓释片中总黄酮苷的含量[J].亚太传统医药,2008,2(2)45-47.

[9]孙斌,瞿伟菁,张晓玲,等.高效液相色谱法测定沙棘籽渣中黄酮苷元含量[J].中国药学杂志,2005,1(2):139-141.

[10]廖声华,田秋霖,路平.Al-桑色素二元络合物的荧光光度法测定银杏叶中的黄酮含量[J].数理医药学杂志,2004,17(1):58-60.

[11]张仁学,陈熙佳,陈刚,彭艳,卓尚振.同步荧光法测定三月泡叶中总黄酮含量的研究[J].中国民族民间医药杂志,2005,75:238-240.

[12]MullerA，GanzeraM，StuppnerH．AnalysisofheaerialpartsofverbenaOfficinalisL.bymicellarelectrokineticcapillarychromatography[J].Chromatographia,2004,12(18)：17-19.

[13]陈刚,叶建农,张剑霞.槐米中芦丁和槲皮素的毛细管电泳-电化学检测[J].华东师范大学学报:自然科学版,2001,(4):82-87.

[14]王月伶,吕元琦,袁倬斌.毛细管区带电泳法研究不同炮制方法对槐花、槐米中芦丁和槲皮素含量的影响[J].理化检验?化学分册.2007,43(1):48-50.

[15]胡钢亮,吕秀阳,吴建国.近红外漫反射光谱法直接测定银杏叶提取物粉末中总黄酮的含量[J].药物分析杂志,2004,24(1):18-20.