基于L-FABP:GFP转基因斑马鱼构建放射性肝损伤模型的初步探讨

基于L-FABP:GFP转基因斑马鱼构建放射性肝损伤模型的初步探讨

胡威

胡威

（遵义医学院附属医院胸部肿瘤科贵州遵义563003）

【摘要】目的：初步探讨以L-FABP10:GFP肝组织特异性转基因斑马鱼建立放射性肝损伤模型的可能性。方法：出生后5天的斑马鱼，给予“剂量爬坡梯度”放疗，连续观察5天，了解幼鱼放疗安全性及安全剂量；结合“剂量爬坡”试验的结果及临床实践，选择合适的剂量进行放疗，连续观察5天，了解放疗后斑马鱼肝脏荧光强度、面积和形态的变化。结果：“剂量爬坡”试验显示：0、2、6、10、20、30、40Gy/次条件下的放射处理对斑马鱼是安全的；接近临床实践剂量40Gy/次的放疗处理未见斑马鱼肝脏荧光强度、范围及形态的变化。结论：L-FABP:GFP转基因斑马鱼放疗后54h内无法通过监测肝GFP荧光变化了解放射性肝损伤情况，该模型的建立仍需要进一步探讨。

【关键词】放疗；斑马鱼；肝损伤；模型

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）24-0017-03

EstablishmentofRadiation-inducedLiverInjuryModelwithLFABP:GFPTransgeneZebrafish

HuWei。DepartmentofThoracicCancer,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,GuizhouProvince,Zunyi563003,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheestablishmentofradiation-inducedliverinjurymodelwithL-FABP:GFPtransgenezebrafish.Methods5dayspost-birthzebrafishesweregivenDoseclimingtestradiationandtoassesstheradiationalsecurityandchoosethesafedoses5dayslater.Combindedtheaboveresultswithclinicalpracticestochooseappropriatedradiationaldoses,continuouslyobservedthestrength,areaandshapechangesoffluorescencefor54hafterradiation.ResultsDoseclimingtestshowthatitissafetoradiateunder0，2,6,10,20,30,40Gy/FforZebrafish.Therewerenosignificantstrength,areaandshapechangesoffluorescenceunderthedosesneartoclinicalpracticedose(40Gy/F).ConclusionTheradiation-inducedliverinjuryofL-FABP:GFPtransgenezebrafishcan’tbeobservedafterradiationin54hbyevaluatingthelivefluorescencechanges.So,themodelneedfurtherresearches.

【Keyword】Radiotherapy;Zebrafish;Liverinjury;Model

原发性肝癌（HCC,hepatocellularcarcinoma）以手术及介入治疗为主，放疗因其剂量限制性毒性，作用有限，但手术及介入治疗已遇到技术上的“瓶颈”，因而提高放、化疗疗效，是当前提高肝癌治疗水平的关键[1,2]。正常肝细胞对放疗敏感，低剂量的放射处理即可造成严重的肝损害[2]，但其机理不清，建立有效的放射性肝损伤模型是阐明放射性肝损伤机制，减轻放射性肝损伤，以及提高放疗剂量和改善放疗疗效的前提。本文通过L-FABP10:GFP肝转基因斑马鱼，初步探讨以其建立放射性肝损伤模型的可能性。

1.实验材料及方法

1.1材料

1.1.1试验动物L-FABP10:GFP肝组织特异性转基因斑马鱼（由西南大学罗凌飞教授惠赠）。

1.1.2试验主要仪器：CBI50恒温培养箱（Binder，France）,MVX-10荧光显微镜（Olympus，janpan），Varian600直线加速器（Varian，USA）。

1.2方法

1.2.1斑马鱼放疗处理

出生后5天斑马鱼被置于6孔板（多条/孔，集体喂养）或24孔板中（1条/孔，用于单一追踪），尽量减少培养孔板中的液体量，但不影响鱼的存活及活动，6MV光子线，源皮距照射,源皮距100cm，剂量率(500cGy/min),机架角度0°，培养板上方置放1cm厚的有机玻璃板。

1.2.2“剂量爬坡试验”观察斑马鱼对放疗的耐受情况

基于斑马鱼放射损伤模型的建立是个新的领域，尚无合适的放疗剂量参考，结合临床实践，建立了一个“剂量爬坡梯度”，分别为：0Gy、2Gy、6Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy/次/天，取出生后5天斑马鱼各15只，分别置于6孔板中按分组及上述照射方法分别给予放射处理，每孔重复3次，各剂量下连续观察5天，统计5天后各剂量条件下存活及未畸变斑马鱼数。

1.2.3连续54h观察同一斑马鱼放疗后荧光变化：

结合“剂量梯度试验”的结果及临床实践，选择合适剂量，于24孔板中连续追踪同一条斑马鱼肝脏GFP荧光，每孔一条，重复3次，选取多个时间点采图，了解斑马鱼肝脏荧光强度、面积及形态变化。

1.2.4统计学处理

采用spss13.0统计软件进行统计处理，率的检验采用χ2检验，P<0.05表明差异有统计学意义。

2.结果

2.1剂量梯度试验：

各放疗剂量下，放疗5天后存活+未畸变斑马鱼数量未见明显差异（χ2=1.21，P=0.97〉0.05），说明给斑马鱼临床接近的放疗总剂量40Gy是安全的，适合进行损伤模型探讨。

图2、40Gy放疗剂量下不同时间点斑马鱼肝脏GFP荧光变化

Fig2.TheGFPfluorescentchangeofzebrafishliverafter40Gyradiationatdifferenttimepoints

3.讨论

我国是HCC发病大国，既往HCC治疗主要以手术和局部介入灌注或栓塞治疗为主，虽然经过外科和介入治疗专家不懈的努力，疗效无法进一步提高已成不争事实[1]。在多学科综合治疗的背景下，近年内科学家应用多靶点分子靶向药物“Sorafenib”已取得了令人瞩目的疗效，患者生存及预后明显改善[3]；与此同时放射物理学家也在不断尝试，试图通过提高放疗精度、呼吸门控或重离子技术等放射物理学的手段或方法来提高放疗疗效，但众所周知限制放疗在HCC中应用的主要因素是正常肝细胞对放射线较敏感，较低剂量的放射剂量就会造成放射野内、外严重的肝纤维化及程度不一肝功能损害，因此明确肝细胞放射敏感的机制并寻找有效的保护措施才是推进放疗在HCC中应用的关键[2],这迫使我们对肝细胞放射损伤机制认识的要求进一步提高，然而好的机制研究往往需要较好的动物模型，近年放射性肝损伤模型的建立主要集中在鼠和灵长目动物上[4-6]，这两类模型的建立一方面实施困难，另一方面也无法进行后续高通量研究，因此相关报道并不多见。斑马鱼是目前极具应用前景的模式生物，其生长繁殖迅速，环境要求低，易于大规模喂养，且同人类基因组有高达80%的相似度，被广泛应用于各种人类疾病模型的建立，以及各种疾病机制和各类药物的高通量筛选[7,8]。L-FABP:GFP转基因斑马鱼是一种肝组织特异性GFP表达的斑马鱼品系，其除了具有斑马鱼的一般优点外，鱼肝能够自发GFP荧光，因此可简单、直观的通过显微镜观察肝脏荧光的强弱、范围和形态来判断肝脏损伤的程度，所以被广泛应用于各种肝损伤模型的建立和保肝药物的高通量筛选[9-11]，但目前尚未见应用斑马鱼构建放射性肝损伤模型的相关报道，本研究即是探讨基于该品系斑马鱼建立放射性肝损伤模型的可能性。

首先，通过我们“剂量爬坡试验”的结果表明接近临床总剂量的放疗剂量（40Gy）并不会造成L-FABP:GFP斑马鱼的大量死亡及畸变，因此该剂量梯度下的研究是安全可靠的，即临床有效放疗剂量下不会影响模型的建立。但是，通过对放疗后斑马鱼肝脏GFP荧光连续54h的观察，并未见到肝脏损伤性变化，这表明54h无法完成我们预期的模型，结合相关文献[4-6]，我们推测原因：1、放射性肝损伤已经存在，但GFP荧光无法明确将放射性损伤标记出来。2、放射性肝损伤是个较为缓慢的过程，短时间（54h）内尚未表现出来。3、斑马鱼尚处于幼年期，肝脏对自身损伤的修复能力较强，损伤短期内被迅速恢复。结合上述推测，我们考虑下步做如下调整：结合其他的检测手段，如HE染色、原位杂交等手段检测肝损伤；延长监测的时间（2个月以内，荧光受鱼皮色素覆盖前），将可能的慢性放射损伤记录下来；换用成鱼进一步试验，当然这些探讨的难度将会进一步增加，如斑马鱼单一追踪的长期喂养，鱼需单一追踪需要大量鱼缸及场地；若用成鱼试验，鱼肝的荧光可能受到鱼皮色素的干扰等等。

无论无何，L-FABP:GFP转基因斑马鱼的优势是毋庸置疑的，成功的模型建立将会极大推动放射性肝损伤研究，在上述基础上，我们定会做更为深入的探讨。

【参考文献】

[1]ChenJ,XiW,WuBetal.Clinicalobservationoftranscatheterarterialchemoemb--olizationPlussorafenibinthetreatmentofhepatocellularcarcinomawithportalveintumorthrombosis[J].ZhonghuaYiXue,2014,94(33):2566-2569.

[2]QIWX，FuS，ZhangQ,etal.Chargedparticletherapyversusphotontherapyforpatientswithhepatocellularcarcinoma:Asystematicreviewandmeta-analysis[J].RadiotherOncol,2014,13(033):1-7.

[3]PengS,ZhaoY,XuFetal.Anupdatedmeta-analysisofrandomizedcontrolledtrialsassessingtheeffectofsorafenibinadvancedhepatocellularcarcinoma[J].PLoSOne,2014,9(12):e112530.

[4]ZhangJ,ZhouS,ZhouYetal.Hepatocytegrowthfactorgene-modifiedadipose-derivedmesenchymalstemcellsameliorateradiationinducedliverdamageinaratmodel[J].PLoSOne,2014,9(12):e114670.

[5]YannamGR,HanB,SetoyamaK,etal.Anonhumanprimatemodelofhumanradiation-inducedvenocclusiveliverdiseaseandhepatocyteinjury[J].IntJRadiatOncolBiolPhys,2014,88(2):404-11.

[6]RanY,WangR,GaoQ,etal.Dragon'sbloodanditsextractsattenuateradiation-inducedoxidativestressinmice[J].JRadiatres,2014,55(4):699-706.

[7]KajimuraS,AidaK,DuanC.UnderstandingHypoxia-InducedGeneExpressioninEarlyDevelopment:InVitroandInVivoAnalysisofHypoxia-InducibleFactor1-RegulatedZebraFishInsulin-LikeGrowthFactorBindingProtein1GeneExpression[J].MolecularandCellularBiology，2006，26(3):1142-1155.

[8]EllisLD,SooEC,Achenbach，etal.UseofthezebrafishLarvaeasaModeltoStudyCigaretteSmokeCondensateToxicity[J].PLoSONE，2014，9(12):e115305.

[9]TsedensodnomO,VacaruAM,HowarthDL,etal.Ethanolmetabolismandoxidativestressarerequiredforunfoldedproteinresponseactivationandsteatosisinzebrafishwithalcoholicliverdisease[J].DiseaseModels&Mechanisms,2013,6(5):1213-1226.

[10]Lee.HC,LuPN,HuangHL,etal.ZebrafishtransgeniclinehuORFZisaneffectivelivingbioindicatorfordetectingenvironmentaltoxicants[J].PLoSOne.,2014,9(3):e90160.

[11]GorelickDA,IwanowiczLR,HungAL,etal.Transgeniczebrafishrevealtissue-specificdifferencesinestrogensignalinginresponsetoenvironmentalwatersamples[J].EnvironHealthPerspect,2014,122(4):356-62.

基金项目名称：贵州省遵义医学院联合基金项目，黔科合J字LKZ[2013]41号