体外高氧对早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响

体外高氧对早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响

邹冬梅1（通讯作者）李龙辉2王少华2

1深圳市儿童医院广东深圳518026；2南华大学深圳市福田区妇幼保健院儿科广东深圳518045

【摘要】目的研究不同浓度及时间氧暴露后早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡情况；方法将新鲜完全培养基培养早产小鼠肺成纤维细胞即L929细胞于21%、40%、60%、90%的氧浓度暴露3、7、14天后，用MTT法、AnnexinV-FITC和PI双染色法检测细胞增殖与凋亡。结果1.高氧暴露后L929细胞增殖活性减弱；2.高氧暴露会加速L929细胞凋亡坏死。结论高浓度氧会抑制早产鼠肺成纤维细胞的增殖，同时加速其凋亡。

【关键词】肺成纤维细胞；MTT；细胞增殖；细胞凋亡；双染色法

早产儿肺发育不成熟，出生后将有更多机会接受氧疗，更易暴露于高体积分数氧、机械通气、感染、炎症损伤等不利环境之中，加之其肺表面活性物质系统和抗氧化酶系统发育不成熟且功能不足[1]，高体积分数氧进入肺部后，产生氧自由基，进一步引起肺部炎症反应、组织损伤和异常修复，产生以肺部炎症和肺纤维化为主要特征的另一并发症[2]，即支气管肺发育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）。

多种因素所造成的肺损伤最终导致肺间质纤维化，实质是细胞增殖与细胞凋亡的过程。肺损伤后巨噬细胞活化，释放致纤维化物质刺激成纤维细胞大量增殖并聚集，细胞外基质积聚同时伴随炎症改变和损伤，导致肺组织结构破坏，最终形成肺纤维化。细胞凋亡的另一种专业术语是程序性细胞死亡，可能是高氧肺损伤的重要组织学特点之一[3]，在高氧肺损伤的发病过程中起着非常重要的作用，可导致肺组织气血屏障受损和间质水肿，并可能激活成纤维细胞及损害细胞的修复过程，最终导致肺纤维化[4]。BPD时，肺纤维化形成的主要细胞是成纤维细胞，该实验参照高氧肺损伤的动物实验模型[5]，利用原代培养的早产鼠肺成纤维细胞，制作氧化性细胞模型，通过MTT法测肺成纤维细胞增殖，AnnexinV-FITC和PI双染色法、应用流式细胞仪检测肺成纤维细胞凋亡，研究不同浓度及时间氧暴露对早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1实验对象

早产小鼠肺成纤维细胞株L929购自美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC），并液氮保存。

1.2主要试剂

RPMI-1640（Hyclone公司），FBS培养基（Hyclone公司），噻唑蓝（MTT）（Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Invitrogen公司），75%乙醇（无锡市展望科技有限公司）。

2结果

2.1不同浓度时间氧暴露对L929细胞增殖的影响

40%、60%及90%氧暴露组3d、7d、14d的L929细胞的活细胞数较同时点空气对照组减少，差异有显著性（P＜0.01）；60%及90%氧暴露组7d、14d的L929细胞的活细胞数较同组前一时点减少，差异有显著性（P＜0.01）；90%氧暴露组14d的L929细胞的活细胞数较同时点60%氧暴露组减少，差异有显著性（P＜0.01）（表1）。40%、60%及90%氧暴露组3d、7d、14d时对L929细胞的抑制率随时间和氧浓度增加而增加（表2）。

2.2不同浓度时间氧暴露后L929细胞的死亡

AnnexinV-FITC和PI双标记法检测高氧暴露后L929细胞凋亡结果显示：（1）早期凋亡率：40%、60%及90%氧暴露组3d、7d、14d早期凋亡数有所增加，较同一时点空气对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；40%、60%及90%氧暴露组7d、14d早期凋亡数较同组前一时点增加，差异有显著意义（P＜0.01）；90%氧暴露组3d、7d、14d早期凋亡数较同时点60%氧暴露组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。（2）晚期凋亡率：60%及90%氧暴露组3d、7d、14d晚期凋亡数有所增加，较同一时点空气对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；40%氧暴露组3d、14d晚期凋亡数较同一时点空气对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；60%及90%氧暴露组7d、14d晚期凋亡数较同组前一时点增加，差异有显著意义（P＜0.01）；40%氧暴露组14d晚期凋亡数较同组前一时点增加，差异有显著意义（P＜0.01）；90%氧暴露组7d、14d晚期凋亡数较同时点60%氧暴露组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

3讨论

氧疗是新生儿尤其是早产儿面临缺氧状态时的一项重要治疗措施，适宜的氧疗在早产儿全身代谢、生长发育、生命安全极为重要。但长时间吸入高体积分数氧却导致氧中毒，且氧中毒最直接的损害器官是肺脏，高氧肺损伤是危重新生儿抢救后出现的主要并发症之一。

肺成纤维细胞是BPD肺纤维化修复的主要细胞[6-7]。本实验细胞凋亡结果显示：与空气对照组相比，大于等于60%的氧暴露后肺成纤维细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率增加，时间越长，加速凋亡的效果越明显；90%的氧暴露3d与比60%氧同时点的晚期凋亡率变化不大，7d、14d时90%的氧暴露组晚期凋亡率比同时点60%氧暴露组均有增加；说明高浓度氧总体趋势是抑制肺成纤维细胞凋亡的。综上所述，我们发现，单纯高体积分数氧暴露于体外培养的早产小鼠肺成纤维细胞时，可抑制细胞增殖，加速其凋亡，从而导致细胞总数减少。

虽本实验出现的高体积分数氧对肺成纤维细胞增殖的结果与支气管肺发育不良时的最终病理改变肺成纤维细胞过度异常增殖相反，也有研究发现，体外高氧对成纤维细胞的直接作用是抑制增殖，促进细胞凋亡。赵诗萌[8]等在体外高氧对胚肺成纤维细胞增殖和凋亡影响的实验中发现，1-5d空气对照组细胞总数呈指数增长，而高氧组1d时的细胞总数与空气对照组差异无统计学意义，2d后细胞数量不断减少，至5d时仅达空气对照组细胞总数的1/4。蔡小芳[9]等在高氧对胎鼠肺成纤维细胞增殖和p53及增殖细胞核抗原表达的体外细胞实验中发现，体外高氧暴露可抑制增殖细胞核抗原的表达、促进p53表达，从而抑制成纤维细胞增殖。本实验的创新之处在于系统从早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡角度来探讨高体积分数氧对肺成纤维细胞的影响，更接近于早产儿支气管肺发育不良。体外高氧为何会抑制早产鼠肺成纤维细胞增殖，其具体机制尚不太清楚，因此我们的后续实验研究进一步探讨发生这一结果的信号通路和纤维化效果因子。

参考文献：

[1]SaugstadOD.Bronchopulmonarydysplasia-oxidativestressandantioxidants[J].SeminNeonato，l2003，8（1）：39-49.

[2]AmbalavananN，CarloWA，D'AngioCT，etal.Cytokinesassociatedwithbronchopulmonarydysplasiaordeathinextremelylowbirthweightinfants[J].Pediatrics，2009，123（4）：1132-1141.

[3]ZhangM，LinL，LeeSJ，etal.Deletionofcaveolin-1protectshyperoxia-inducedapoptosisviasurvivin-mediatedpathways[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2009，297（5）：L945-L953.

[4]YoungLR，PasulaR，GullemanPM，etal.SusceptibilityofHermansky-Pudlakmicetobleomycin-inducedtypeIIcellapoptosisandfibrosis[J].AmJRespirCellMolBiol，2007，37（1）：67-74.

[5]LorneE，ZhaoX，ZmijewskiJW，etal.Participationofmammaliantargetofrapamycincomplex1inToll-likereceptor2-and4-inducedneutrophilactivationandacutelunginjury.AmJRespirCellMolBiol[J].2009，41：237-245.

[6]HigashiyamaH，YoshimotoD，OkamotoY，etal.Receptor-activatedSmadlocalisationinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis[J].JClinPathol，2007，60（3）：283-289.

[7]GiordaniVM，DebenedictusCM，WangY，etal.Epidermalgrowthfactorreceptor（EGFR）contributestofetallungfibroblastinjuryinducedbymechanicalstretch[J].JReceptSignalTransductRes，2014，34（1）：58-63.

[8]赵诗萌，曹美玲，吴红敏.体外高氧对人胚肺成纤维细胞增殖、凋亡的影响[J].山东医药，2011，51（41）：22-24.

[9]蔡小芳，孙继民，李文斌.高氧对胎鼠肺成纤维细胞p53和增殖细胞核抗原表达的影响[J].中国当代儿科杂志，2014，16（9）：922-926.

注：基金项目：国家自然科学基金（30973218）；深圳市科技创新委员会2014年立项课题（JCYJ20140415094713878）