简介:目的构建长链非编冯RNABRE-AS1的慢病毒表达载体。方法利用重叠延伸PCR法构建出BREAS1的全长目的片段,将全长目的片段及慢病毒载体质粒pCDHCMVMC8EF1分别双酶切后进行连接,转化到感受态大肠杆菌后,通过DNA测序鉴定筛选出阳性菌落,提取目的质粒。利用目的质粒制备包装慢病毒,并感染肾细胞癌细胞系OS-RC-2,分别利用荧光显微镜和荧光实时定量PCR检测细胞中BREAS1是否过表达。结果重叠延伸PCR得到正确的BREAS1全长序列,经过双酶切、连接、转化、筛选及I)NA测序,成功构建重组慢病毒载体质粒pCDH-BRE-AS1。通过荧光显微镜检测,几乎昕有经过嘌呤霉素筛选的OSRC2细胞均具有绿色荧光,显示其被重组慢病毒感染;荧光实时定量PCR显示,感染了RNABRE-AS1慢病毒的OSRC2细胞中,BREAS1的表达水平上升了38.5倍。EdU插入实验显示BREASl抑制肾癌细胞的增殖。结论本研究成功构建了BRE-AS1的慢病毒表达载体,并证明BREAS1能抑制肾癌细胞增殖。
简介:目的:探讨改良免疫组化染色法在诊断乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)的应用前景。方法:改良免疫组化染色法采用高温高压+XXIV型蛋白酶消化的抗原修复法,行一抗和二抗两步孵育法,其中二抗与酶标多聚体相连。病人肾组织标本同时行免疫荧光染色法检测作对照。结果:(1)40例血清学HBsAg阳性患者的肾穿组织标本中,改良免疫组化染色法HBsAg阳性27例,阳性率为67.5%;HBcAg阳性7例(其中HbsAg同时阳性6例,HbsAg阴性1例),阳性率为17.5%;HbsAg、HBcAg同时阴性12例。免疫荧光染色法HBsAg阳性29例(72.5%);HBcAg阳性10例(25.0%,均同时呈HbsAg阳性);HbsAg、HBcAg同时阴性11例。(2)两种染色比较,HbsAg阳性率相近(改良组化67.5%VS荧光72.5%),其中同时阳性的有22例,同时阴性的5例,总一致率为67.5%(27/40),阳性一致率在改良免疫组化染色中为81.5%(22/27),在免疫荧光染色中为75.9%(22/29)。(3)10例血清丙氨酸转氨酶升高的患者中,改良免疫组化HbsAg染色阳性9例,免疫荧光染色阳性7例;血白蛋白〈30g/L而尿Pro定量未达到〉3.5g/24h的患者7例;6例病理呈膜性或/和膜增殖性肾炎(其中改良组化染色阳性5例,荧光染色阳性3例)。有2例行肝组织穿刺活检,病理显示肝脏病变。结论:改良免疫组化染色可提高HBV-GN的乙肝抗原检测率,有临床应用推广价值。
简介:目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR、WesternBlot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。
简介:目的探讨双向凝胶电泳和质谱技术在高级别前列腺上皮内瘤(high-gradeprostaticintra-epithelialneoplasia,HGPIN)和前列腺癌(PCa)患者血清蛋白表达研究中的应用。探索HGPIN向PCa发生发展的可能机制。方法研究组为11例HGPIN患者,对照组为15例PCa患者。用二维电泳(two-di-mensionalgelelectrophoresis,2-DE)和质谱分析(massspectrometry,MS)对两组患者的血清蛋白质组学进行研究,并用ELISA方法进一步确认。结果在两组中发现了12个差异蛋白质点,其中色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)在PCa患者中显著下调。结论蛋白组学研究方法对HGPIN和PCa患者的血清进行差异比较是有效、可行的。PEDF可能与HGPIN向PCa发生发展的分子生物学机制密切相关。
简介:目的研究长链非编码RNA-NR_024158在肾肿瘤中的表达及其调控机制,并探讨其对肾肿瘤细胞增殖和迁移的影响。方法逆转录实时定量PCR检测NR_024158在肾肿瘤组织和细胞系中的表达;甲基化特异性PCR检测NR_024158启动子区甲基化状态;逆转录实时定量PCR检测非特异性去甲基化药物(5Aza.dc)处理后肾肿瘤细胞系中NR_024158表达的变化;MTS技术检测过表达NR_024158后细胞的生长情况;Transwell小室实验检测过表达NR_024158后细胞的迁移和侵袭情况。结果肾肿瘤组织和细胞系中NR_024158的表达较相对参照系(HK-2)降低;NR_024158启动子区存在甲基化;5Aza.dc处理后,肾肿瘤细胞系NR_024158的表达明显增加;过表达NR_024158后肾肿瘤细胞系的增殖和迁移、侵袭明显受到抑制。结论NR_024158在肾肿瘤中发挥抑癌基因样作用,其表达受甲基化调控。
简介:目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)H19促进膀胱癌细胞增殖的分子机制。方法(1)应用实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)分别检测膀胱癌组织中lncRNAH19和miRNA-29c-3p的表达并分析其相关性。(2)应用RNA干扰和细胞转染技术抑制膀胱癌细胞系T24及5637中H19基因的表达,其后通过细胞增殖实验检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期变化;RTqPCR检测细胞中H19的表达变化。(3)在膀胱癌细胞系T24和5637中共表达miR-29c-3p和H19,运用荧光素酶报告系统验证miR-29c-3p对H19及细胞周期蛋白D2(CCND2)的靶向作用,应用Westernblot检测膀胱癌细胞系T24与5637中抑制H19表达后CCND2的表达变化。结果H19在膀胱癌中高表达,miR-29c-3p在膀胱癌中低表达,H19和miR-29c-3p的表达为负相关,H19与CCND2的表达为正相关。MiR-29c-3p可同时靶向H19及CCND2。在膀胱癌细胞系中过表达miR-29c-3p可以抑制H19的表达,miR-29c-3p在膀胱癌中起肿瘤抑制作用,而H19具有促进癌细胞增殖和改变细胞周期的能力,表现为癌基因样作用,抑制膀胱癌细胞系T24和5637中H19的表达可以在翻译水平减少CCND2的表达。结论lncRNAH19通过与CCND2竞争结合miR-29c-3p,降低miR-29c-3p对CCND2的表达抑制,从而在膀胱癌中发挥肿瘤促进作用。